猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析硕士论文

硕士猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析2009硕士学位论 文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析二九 年 六 月 硕士学位论文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析学科专业 预防兽医学 指导教师 教授 副研究员 论文答辩日期 学位授予日期 答辩委员会主席 论文评阅人 / 文档可自由编辑打印广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 年 月 日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：即时发布 解密后发布（保密论文需注明，并在解密后遵守此规定）论文作者签名： 年 月 日导师签名： 年 月 日猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析中文摘要脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、心病毒属（Cardiovirus）的成员，可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。针对猪EMCV VP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物，以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好，标准曲线的相关系数达到0.991；敏感性高，初始模板的检出下限为1×101拷贝/L，比常规PCR方法高100倍；特异性强，与其它猪源病毒均不发生交叉反应；重复性好，组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测，结果1份为阳性。将该份疑似病料上BHK-21细胞，并对其进行特性鉴定，确诊为EMCV，命名为EMCV-GXLC，设计5对引物，采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框（ORF）序列，应用3-RACE和5-RACE技术扩增分离株的3-UTR和5-UTR，分别进行扩增片段的克隆和测序。结果表明，EMCV-GXLC株基因组全长7 725 nt，编码区为6 879 nt，编码2 292个aa，将该株全基因组上传NCBI，GenBank登录号：FJ897755。应用分子生物学软件对EMCV-GXLC全基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。全基因组比对结果表明，分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853，北京的DQ464062，河北的DQ464063，韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高，达99.5%以上。各个片段推导的氨基酸同源性分析显示，非结构蛋白比结构蛋白保守；在非结构蛋白中，3D蛋白最为保守，2A相对变异较大，预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因；在结构蛋白中，VP2蛋白相对保守，VP1蛋白同源性最低、变异性较大，适合用于分子流行病学的调查。VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序，分别为N29QT和N62QT，VP1是表位最多的区域，预测有9个可能的表位；VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。3-UTR和5-UTR二级结构分析显示，FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。进化树分析显示，结构蛋白与全基因序列的系统发育进化树相近，且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似，在分析EMCV分离株的进化关系时，可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。关键词：猪脑心肌炎病毒；荧光定量PCR；分离；测序；全基因组；进化分析ISOLATION AND GENOMIC SEQUENCE ANALYSIS OF PORCINE ENCEPHALOMYOCARDITIS VIRUS GUANGXI STRAIN英文摘要Encephalomyocarditis virus (EMCV) is a member of the genus Cardiovirus of the family Picornaviridae, it is clinically characterized by encephalitis, myocarditis or inflammation around cardiac muscles.A pair of primers was designed according to the sequence of the VP1 gene of EMCV and a real-time PCR assay based on SYBR Green I for detection of EMCV was established. The assay had a good linear relationship between initial templates and Ct values, and the correlation coefficient of the standard curve was 0.991. Also, it was highly sensitive and had a detection limit of 1×101 copies/L of initial templates, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. Moreover, it was highly specific and had no cross-reaction with other porcine viruses. Finally, it was highly reproducible and had a coefficient of variations less than 3 percent for both intra- and inter-assay. One EMCV strain was isolated from the clinical tissue samples orignated from pig farms in Guangxi by using BHK-21 cells. This isolate was designated EMCV-GXLC（GenBank accession No. FJ897755），and identified using IFA. The virus particles with diameter of 27 nm were observed by immune electron microscopy (IEM). Five pairs of primers were designed and five overlapping cDNA fragments covering the complete open reading frame (ORF) within BJC3 and HB1 were amplified using RT-PCR. The 5'-rapid amplification of cDNA ends (RACE) and 3'-RACE were employed to amplify the 5'-untranslated region (UTR) and 3'-UTR of the RNA of the viruses. The sequences of RT-PCR-generated cDNA fragments from EMCV-GXLC viruses were assembled. The complete genomes of EMCV-GXLC consisted of 7 725 nucleotides, and possessed a large ORF with a size of 2 292 amino acids. The homology of the genomic nucleotide sequences and the predicted amino acids were aligned and analyzed among EMCV-GXLC and other EMCV strains available in GenBank. The results showed thatKEY WORDS: encephalomyocarditis virus (EMCV)；real-time PCR；isolation； sequence；genome；phylogenetic analysis目录中文摘要I英文摘要II目录III插图和附表VI插图清单VI附表清单VII缩略词表VIII1.文献综述11.1EMCV基因组结构11.1.1EMCV衣壳蛋白及其功能21.1.2EMCV非结构蛋白P2和P331.1.3EMCV 5-UTR结构与功能31.1.4EMCV 3-UTR51.2EMCV诊断技术51.2.1病毒分离51.2.2抗体检测方法51.2.3抗原检测方法61.3EMCV的流行情况及流行特点61.3.1流行情况61.3.2流行特点71.4EMCV的公共卫生学意义81.5研究内容与技术路线91.5.1研究内容91.5.2技术路线102.猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立错误！未定义书签。2.1材料与方法错误！未定义书签。2.1.1病毒与引物错误！未定义书签。2.1.2主要试剂错误！未定义书签。2.1.3试验用溶液配制错误！未定义书签。2.1.4主要仪器设备错误！未定义书签。2.2方法错误！未定义书签。2.2.1质粒标准品的制备错误！未定义书签。2.2.2Real-time PCR反应条件的优化错误！未定义书签。2.2.3Real-time PCR标准曲线的制作错误！未定义书签。2.2