蛋白质多肽的氨基酸组成与序列分析报告
.第十章 蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质,它们参与机体的代谢过程,具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时,往往需要将其进行完全水解,测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用,为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响,也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。除了氨基酸总量测定外,往往更需要对个别氨基酸进行分析。常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序,既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础,又有助于蛋白质的基因结构的研究。在某些特定情况下,基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变,从而引起功能失调和疾病产生。因此,测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。§10. 1 氨基酸的衍生化间接分析法无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定,由于多数氨基酸都缺少结构检测特征,既无紫外吸收,又无荧光,必须使之衍生,转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。§10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应为了使测定氨基酸的方法灵敏度高,分辨率好,氨基酸的衍生化是关键步骤之一。近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛OPA、丹酰氯Dansyl-Cl、异硫氢苯酯PITC、氯甲酸芴甲酯FMOC-Cl等。茚三酮在酸性pH = 3 4和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝紫色的复合物最大吸收波长为570 nm：<10.1>除了a-氨基酸外,其它的氨基酸也可生成有色物质,但无二氧化碳生成,b-,g-,d-和e-氨基酸比a-氨基酸反应慢得多,生成的是蓝色物质,而亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物最大吸收波长为440 nm。氨基酸与茚三酮的反应主要用于柱后衍生,也可用于氨基酸的比色分析,是公认的氨基酸总量的定量方法。在定量分析时,必须除去对测定有干扰的蛋白质、氨和尿素。邻苯二甲醛OPA与巯基试剂,通常与b-巯基乙醇连用,在碱性条件下与第一级氨基酸迅速反应生成1硫代2烷基异吲哚,加成物可产生荧光,在紫外区也有较强的吸收,反应式如下：<10.2>该反应不仅适用于柱前衍生,也适用于柱后衍生,它既可进行高灵敏度的荧光检测lex = 340 nm,lem = 450 nm,检测限达mol L-1,也可进行一般的紫外检测最大吸收波长为230 nm,检测限达5mol L-1。紫外检测的线性范围为10 200 pmol,荧光为0.8 15 pmol,OPA本身不干扰分离和检测,不必除去过量试剂,色谱图基线也比较平稳。OPA法主要的缺点是：1亚氨基酸不能与其直接反应,需先氧化如用次氯酸钠开环后才能反应。2荧光产物不稳定。丹酰氯Dansyl-Cl在碱性条件下与氨基酸反应生成强荧光物质,它同一级、二级氨基酸都能起反应,但是反应速率比较慢,在室温条件下需35 min左右,反应产物的转化率与反应时间关系较大,反应温度升高可以加速产物转化,但最高不可超过60,否则Dansyl-Cl会发生水解,反而使产物转化率降低。<10.3>Dansyl-氨基酸在酸性条件下pH = 2 3一般可被乙酸乙酯抽提,大量的Dansyl-Cl的反应副产物Dansyl-OH留在水相,干扰因素减小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dansyl-丝氨酸和Dansyl-苏氨酸则大部分或部分留在水相,往往会被遗漏,而导致错误结论。Dansyl-Cl法的检测限与OPA法相当,线形范围一般在15 150 pmol。优点是1衍生物比较稳定,一般可放置12 24 h；2Dansyl-Cl胱氨酸衍生物线性关系好,可用于体液中胱氨酸的定量测定。缺点是1反应时间必须严格控制；2衍生物对紫外光照比较敏感,故反应要在避光条件下进行；3易生成多级衍生物,如赖氨酸、组氨酸、色氨酸生成二级衍生物。异硫氰苯酯PITC可以和一级、二级氨基酸反应,在室温条件下仅十分钟即可完成,反应产物具有紫外吸收最大吸收波长为254 nm。PITC的衍生物单一、稳定,-20 可贮存数月,4 水溶液可保存3天; 分析时间短,结果准确,紫外检测限可达1 pmol。<10.4>PITC法最大的缺点就是氨基酸衍生时需要真空干燥以除去过量试剂。氯甲酸芴甲酯FMOC-Cl能与一级、二级氨基酸的氨基反应,生成的衍生物可用荧光检测lex = 260 nm,lem = 310 nm,FMOC-Cl与氨基酸反应迅速,实温下约30s即可完成。反应产物稳定,在4 避光条件下可储存13天,在酸性条件下也可稳定30小时以上。反应有很高的灵敏度,检测极限为1 pmol,色谱分离中有很好的分辨率和分离速度。该法最大的优点是不受样品基质的干扰。<10.5>FMOC-Cl法最大的缺点是1与His形成单、双衍生物的比例不稳定,影响定量。2FMOC-Cl在衍生过程中易产生试剂的水解反应,过量的FMOC-Cl及其水解产物均有和FMOC-氨基酸类似的荧光,可用戊烷抽提去除干扰,但抽提效率约为70%,只能除去部分干扰；另一种方法是采用1-氨基金刚烷与过量的FMOC-Cl试剂反应,生成的衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰,这就排除了试剂峰的干扰。2、4二硝基氟苯FDBN在碱性条件下pH = 9.5与氨基酸或肽的游离氨基反应生成黄色的二硝基苯酚DNP的衍生物。反应速率较慢,在50暗处需要60分钟左右。DNP-衍生物避光条件下比较稳定,在室温避光条件下可保存7天,在4条件下可保存30天。FDBN能与一级、二级氨基酸反应,DNP-衍生物的检测波长为360 nm, 最小检出量可达10 pmol。不足之处是与谷氨酸的衍生化反应较慢。<10.6>荧光胺本身没有荧光,但是在碱性条件下,它与伯胺反应形成具有荧光的产物最大激发波长为390 nm,最大发射光波长475 nm,衍生化产物的荧光强度决定于反应系统的pH值,在pH = 9时,荧光最强,而在pH = 7.4时,只有很低的荧光强度。由于这一反应在室温条件下几秒内即可完成,而过剩的试剂在几秒钟内就会被分解,不干扰测定。由于荧光胺在水溶液中不稳定,必须用丙酮配制。荧光胺不能与仲胺如脯氨酸和羟脯氨酸反应,除非他们与N-氯代琥珀酰亚胺作用转变为伯胺。<10.7>伯胺 荧光胺无荧光 荧光产物荧光黄异硫氰酸苯酯FITC,在pH 9 10范围内与一、二级氨基酸在室温条件下避光反应12 h,生成具有荧光的产物最大激发光波长为490 nm,最大发射光波长为518 nm。过量的试剂不干扰分离,反应液可直接进样分析。衍生化产物单一、稳定,在室温条件下可放置一天。<10.8> FIC-氨基酸6氨基喹啉基N羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯ACQ,在pH 8.2 10.0范围内与一、二级氨基酸迅速反应除了Tyr需加热到50,生成的衍生物具有紫外吸收最大吸收波长为 248nm和荧光lex/lem = 245 nm /395 nm,过量的试剂将快速水解,衍生化产物单一、稳定,在室温条件下可放置一周,在4条件下可保存两周。反应液可直接进样分析。紫外检测的检测限可达pmol,荧光检测的检测限可达40fmol。<10.9><10.10>N羟基琥珀酰亚胺3吲哚乙酸酯SA,是一种较新的衍生化试剂,在pH 8.0 9.5范围内,室温条件下与一、二级氨基酸反应1小时左右低温对该衍生反应有利,但温度太低,反应时间过长,生成荧光衍生物lex/lem = 278 nm / 355 nm,过量试剂不需预先除去,干扰较小,反应液可直接进样进行色谱分析,检出限可达pmol。<10.11>氨基酸 SA 衍生氨基酸 NHS还有一些其他的衍生试剂如3对羟基甲酰喹啉2甲醛CBQCA,试剂本无荧光,在pH 9 左右与一级氨基反应生成稳定的强荧光吲哚衍生物lex/lem为 450 nm/550 nm,冰箱中可保存2周。最低检测限可达5 fmol。N羟基琥珀酰亚胺奈乙酸酯SINA, pH 8.9时与一、二级氨基酸在室温条件下反应45分钟生成具有紫外吸收lmax = 280 nm的衍生物。该衍生物稳定,检测限可达 pmol。4氟7硝基苯并2、1、3噁二唑NBD-F在 pH 8、60条件下与一级和二级氨基反应2 min,然后将pH调至1生成强荧光衍生物lex/lem为470 nm / 530 nm,最低检测限可达 fmol。§10. 1. 2 氨基酸的毛细管电泳分析法毛细管电泳<CE>具有微量、灵敏和柱效高的特点,适合于复杂样品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离模式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。分离各种氨基酸衍生物的缓冲液常为磷酸、硼酸或混合液,也可在 SDS 胶束溶液中加入甲醇、四氢呋喃或尿素等以改善分离度。除了可进行柱前衍生化,还可以进行柱内和柱后衍生化。检测方式可用UV检测,但大部分采用激光诱导荧光检测器LIF,激发/发射波长常用325 / 550 nm 和488 / 525 nm,可检测到 amol 甚至 zmol 水平的量。可用于测定肽或蛋白质经 Edman 降解后的氨基酸以及生理氨基酸。人体体液中生理氨基酸的水平及其改变,不仅受年龄营养状况的影响,而且与某些疾病如肝病、肾病以及先天遗传代谢性疾病等密切相关。为了研究不同疾病状况下氨基酸的代谢情况,需要一种快速测定氨基酸方法以满足其需要。以区带毛细管电泳为分离模式的高效毛细管电泳为快速测定血清中氨基酸提供了有效手段1,见图10.1。图10.1 人血清中氨基酸和内标的毛细管电泳图谱样品预处理：0.5 ml血清加内标10 mmol L-1 D-正白酸20l,加乙腈1.5 ml,涡旋30s,放置10 min后,15000 g离心10 min,上清液备用或置于-20保存。衍生化：待测标本的上清液或氨基酸的标准溶液1 ml,加0.5 mol L-1 pH 9.5硼酸钠缓冲溶液1 ml,加乙腈1 ml , FDBN20l,摇匀,在50水浴加热40分钟。分离条件：1操作缓冲液的组成：0.03 mol L-1 pH 9.8四硼酸钠缓冲液 异丙醇30% Brij = 82515025。2开口石英毛细管：总长度为370 mm,有效长度为300 mm,内径为75m。3电压：28 KV。4温度：15。5进样：压力进样5 s。6UV检测波长：360 nm。该方法在8分钟内可分离血清中16种氨基酸,如图101所示,氨基酸的线性范围10 700 mol L-1,最低检测限为2.5 7.9 mol L-1,回收率为86.3 107.4%。利用FITC柱前衍生-毛细管电泳-激光诱导荧光测定大鼠大脑皮质氨基酸类神经递质含量,如图10.2所示,可用于研究大鼠脑缺血时黄芩甙的药理作用。结果显示大脑缺血时,大脑皮质的Glu, Asp, GABA和Gly浓度升高,而黄芩甙可降低Glu和Asp 的浓度,对脑缺血有保护作用2。样品处理：取大鼠大脑皮质绞碎
