Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价

Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价【摘要】 目的 构建针对人结肠癌细胞系Lovo的高效率沉默Survivin的shRNA表达载体。方法 合成特异性干扰Survivin的小发卡RNA（shRNA）片段，并与pGenesil2 载体连接，构建Survivin干扰载体（pGenesil2Survivin shRNA）。利用脂质体将其转染Lovo细胞，分为正常细胞对照组和3个shRNA干扰组（pGenesil2Survivin1、2及3），应用荧光显微镜对转染效果进行评价，应用Western印迹和免疫细胞化学法分析转染后Lovo中Survivin的蛋白表达水平。结果 插入片段测序结果与合成shRNA结果一致；转染效率可达70%左右，转染pGenesil2Survivin shRNA后，3个干扰组的Lovo细胞中Survivin蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P0.01）。结论 成功构建了能高效沉默Survivin的RNAi表达载体；且pGenesil2Survivin高效抑制结肠癌Lovo细胞中Survivin基因表达。 【关键词】 RNA干扰；生存素；结肠癌；shRNA研究显示，Survivin 在人结肠癌组织以及细胞系中存在高表达，并与人结肠癌的形成和演进存在密切关系，其作用机制可能涉及促进结肠癌恶性增殖及抗细胞凋亡等多个方面1，2。因此，靶向Survivin的研究对明确结肠癌的发病及转移机制以及提高结肠癌的疗效均有重要意义35。故本研究利用pGenesil2真核表达载体构建了含高效的靶向Survivin基因的重组载体pGenesil2Survivin shRNA，并进一步应用其沉默人结肠癌系Lovo的Survivin基因，为探讨Survivin 在结肠癌发生、发展中的作用及应用其进行结肠癌的基因治疗奠定实验室基础。 1 材料与方法 1.1 材料 感受态细胞DH5为我室保存。干扰载体pGenesil1和pGenesil2购自晶赛公司（pGenesil1载体为带有荧光蛋白EGFP基因的pGenesil2序列）。质粒DNA纯化试剂盒及质粒小提试剂盒购自Qiagen公司（荷兰）。所用的酶BamH、Hind、T4 DNA 连接酶、Sal和Pst均购自Takara公司（日本）。 1.2 Survivin shRNA表达载体构建及鉴定 由Genbank查到Survivin的cDNA序列，根据Ambion公司在线设计软件，筛选3个长度均为19 bp的靶定序列，分别为：模板1、2和3分别为正义5GGACCACCGCATCTCTACA3，反义5TGTAGAGATGCGGTGGTCC3；正义5GCATTCGTCCGGTTGCGCT3，反义5AGCGCAACCGGACGAATGC3；正义5GGCTGGCTTCATCCACTGC3；反义5GCAGTGGATGAAGCCAGCC3的靶基因序列。设计3对寡核苷酸序列设计引物。引物结构：在设计的寡核苷酸链中，其两端分别为BamH和Hind的酶切位点，能与线性化载体直接相连，中间的9 个碱基为形成发卡结构的环区，以上序列由上海生工公司合成。线性化pGgenesil2质粒：载体pGenesil2经BamH和Hind双酶切，1琼脂糖凝胶回收大片段。发卡shRNA寡核苷酸链的退火：用50 l 退火缓冲液分别溶解上述合成的寡核苷酸片段。各取2 l（即2 l 正义链+2 l 反义链）+16 l 退火缓冲液混匀。94水浴退火自然冷却至室温。取1 l退火产物+99 l H2O做100倍稀释。重组载体pGenesil2Survivin shRNA的构建：T4 DNA连接酶连接退火寡核苷酸链与线性化载体pGenesil2，建立10 l连接反应体系：取稀释退火寡核苷酸链1 l，线性化pGenesil2质粒载体1 l，10×连接酶缓冲液 1 l，T4 DNA连接酶1 l，H2O 6 l，22水浴反应过夜。细菌转化与质粒提取：取5 l过夜连接产物转化感受态细胞DH5，涂布于含Kana抗性（终浓度为30 mg/L）的LB平板上，37恒温箱培养过夜。从培养皿上挑取3个单克隆菌落接种于3 ml含Kana抗性（终浓度为30 mg/L）的LB培养液中，37恒温摇床（250 r/min）培养过夜。用小提试剂盒小量提取质粒。重组载体的酶切鉴定：质粒分别用Pst和Sal做酶切鉴定，反应条件为：质粒DNA 8 l，10×缓冲液 1 l，Pst和Sal酶各1 l；37水浴反应3 h，1%琼脂糖凝胶电泳；送北京英俊公司测序。 1.3 pGenesilSurvivin shRNA质粒转染人结肠癌Lovo细胞转染效率的测定 将Lovo细胞铺于覆有盖玻片的6孔板内，接种密度约为5×105个/孔。24 h后换液，用脂质体Lipo 2000转染含有荧光发光基因EGFP的pGenesil1载体及pGenesil2Survivin shRNA质粒，转染前12 h换为无双抗的DMEM培养基，然后用无血清无双抗的DMEM培养基转染。转染6 h后换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，转染后48 h盖玻片用荧光显微镜分别观察转染情况。 1.4 pGenesil2Survivin shRNA质粒转染人结肠癌Lovo细胞干扰效果的测定 实验分为4组，分别为正常细胞对照组、pGenesil2Survivin shRNA1、2以及3组，每组设4复孔。Western印迹检测：收集细胞，用0.01 mmol/L PBS缓冲液漂洗3次后加入200 l细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 min后，以Lowry法行总蛋白定量分析。制备12分离胶、5积层胶。按计算好的样品量上样，使各组上样量相等，在8 V/era电压条件下行SDS聚丙烯酰胺电泳，待溴酚蓝进入分离胶时，将电压提高到15 V/era。电泳结束后，将SDS分离出的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上（Millipore,USA）。以含5脱脂奶粉的TBS溶液封闭2 h，PTTG鼠抗人单克隆一抗和actin室温孵育2 h，相应的二抗室温孵育1.5 h，ECL 试剂盒显色，拍照。 2 结 果 2.1 重组载体测序结果 pGenesil2Survivin1、2和3的测序结果显示，设计的3对shRNA片段均已成功地连入pGenesil2载体中，即重组载体pGenesil2Survivin shRNA均构建成功。 2.2 pGenesil2Survivin shRNA载体转染Lovo细胞转染效率的测定 应用与载体pGenesil2具有基本具有相同序列的pGenesil1载体（pGenesil1中比pGenesil2只多出EGFP蛋白的序列）测定转染效率。转染48 h后测定Lovo细胞转染效率结果显示，正常细胞对照组荧光表达百分率约为8%，转染组荧光表达百分率为70%（图1）。即Lovo细胞的转染效率约为62%，已经可以满足实验需要。 图1 荧光显微镜下观察Lovo细胞转染 2.3 pGenesil Survivin shRNA质粒转染Lovo细胞干扰的检测 通过Western印迹测定干扰后Lovo细胞中Survivin蛋白表达情况，pGenesil Survivin shRNA1、2和3转染Lovo细胞中Survivin蛋白表达干扰效率分别为78%、65.2%和69.3%（图2）。 图2 转染pGenesil Survivin shRNA质粒后 Lovo细胞Survivin表达情况 3 讨 论 RNAi介导的特异性同源基因mRNA降解的一种细胞反应过程，是转录后基因沉默(pTGs)的一种形式。RNAi首先由Fier等人于1998年发现并命名6。目前已发现RNAi具有多方面的显著特点79：高特异性，siRNA引起同源基因mRNA的降解具有高度的特异性，因为即使一个碱基的改变往往就会大大降低甚至完全丧失siRNA对靶基因的抑制作用；高效性，RNAi过程一旦被启动，反应信号就可以被一定程度地扩增和放大，最低每个细胞内一份拷贝的siRNA就足以达到基因抑制的效果；高稳定性，通过采用RNAi对线虫全基因组功能进行分析的结果显示，其中50%80%的序列选择有效，12.9%27%的基因抑制产生了明显的异常表型，因此RNAi作用具有很高的成功率和稳定性。此外，RNAi还具有研究周期短、操作简单等突出优点。由于RNAi所具有的上述重要特点，使得它在发现后迅速地发展并展示了其在生命科学研究中有极其广阔的应用前景。RNAi的主要应用方向包括8，10，11：研究基因功能，在后基因组时代规模性的基因功能研究中，通过RNAi特异性抑制基因的表达可获得特定蛋白功能丧失或降低的突变体，从而借以阐明特定基因在生物体中的功能。疾病基因治疗，由于RNAI可以特异性和高效性地抑制基因的表达，毋庸置疑，它将在遗传病、病毒感染和癌症等人类多种顽固性疾病的基因治疗中发挥重要的作用。新药物研究和开发，RNAi可用作寻找新的药物靶标的有效工具，可高通量地对发现的药物靶基因做功能分析，还可以帮助了解药物作用的生化模式等等。正是由于RNAi在生命科学研究中所具有的重大意义，因此将RNAi技术应用到结肠癌的基因治疗中，在治疗策略上或进行多基因联合治疗，或传统治疗与基因治疗联合应用，恶性结肠癌的基因治疗有望产生突破性进展。 本实验表明所构建的pGenesil2质粒载体可有效沉默Lovo细胞中的Survivin基因表达。数据对比分析可以发现，所合成的3组干扰质粒载体中，Survivin shRNA1组干扰效率最高，对Lovo细胞中Survivin蛋白的沉默效率可以达到70%以上，可作为下一步分析研究的优选载体。【参考文献】 1 Okon K,Demczuk S,Klimkowska A,et al.Correlation of microsatellite status,proliferation,apoptotic and selected immunohistochemical markers in colorectal carcinoma studied with tissue microarrayJ.Pol J Pathol,2006;57(2):10511.2 Abd ElHameed A.Survivin expression in colorectal adenocarcinoma using tissue microarrayJ.J Egypt Natl Canc Inst,2005;17(1):4250.3 Tan HY,Liu J,Wu SM,et al.Expression of a novel apoptosis inhibitorsurvivin in colorectal carcinomaJ.World J Gastroenterol,2005;11(30):468992.4 Li B,Fan J,Liu X,et al.Suppression of colorectal tumor growth by regulated survivin targetingJ.J Mol Med,2006;84(12):107786.5 Rodel F,Frey B,Leitmann W,et al.Survivin antisense oligonucleotides effectively radiosensitize colorectal cancer cells in both tissue culture and murine