常用细胞实验
实验室试剂耗材存放位置4°存放：500ml瓶装培养基，配制培养基，10ml或50ml离心管装常用胰酶。-20°存放：500ml瓶装FBS和50ml离心管分装FBS，500ml瓶装胰酶和50ml离心管分装胰 酶，100ml瓶装双抗和1 ml分装双抗，分装抗支原体。室温存放：500ml瓶装HBSS，棕色瓶装DMSO，100ml瓶装NaHCO3。柜子或移动车存放：100ml培养基配制瓶，50ml离心管，15ml离心管，1.8ml冻存管，玻璃 移液管，各种规格的细胞瓶、孔板等。培养基配制注意：配制培养基前一天需将FBS拿到4°冰箱融化。不同培养基配制表血清含量培养基种类配制方法调节pH10% FBSMEM90ml MEM+10ml FBS+ 1ml 双抗+20ul 抗支原体NaHCO3 调 pH 到 7.22% FBSMEM98ml MEM+2ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体10% FBSDMEM90ml DMEM+10ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体2% FBSDMEM98ml DMEM+2ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体10% FBS164090ml 1640+10ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体2% FBS164098ml 1640+2ml FBS+1ml 双抗+20ul 抗支原体细胞培养基选择常用细胞的培养基和培养病毒种类表细胞种类培养基可培养病毒Hep-21640/MEMRSV，肠道病毒，腺病毒等RDMEMEV71， CA16 等VeroMEM麻疹，风疹，汉坦，黄热，埃博拉，西尼罗，基孔肯亚， 尼巴等VeroslamDMEM麻疹，风疹等veroE6DMEM水痘，汉坦，新疆出血热，埃博拉，西尼罗，SARS等MRC5MEM水痘，手足口等BHK21DMEM登革热，乙脑，新疆出血热等C6/361640+DMEM 混合登革热，乙脑等MDCKDMEM流感常用细胞实验操作注意：做细胞实验前，先进实验室打开生物安全柜或超净工作台紫外和房间紫外，必要时打 开水浴锅，准备好所有实验用品，待紫外照射半小时后进入细胞房操作。所有枪头，移液管，EP管等均高压灭菌烘干后使用。结束实验后将培养基等放回冰箱，废气物处理干净，需要高压的进行高压灭菌，打开生物安 全柜或超净工作台紫外和房间紫外待紫外照射半小时后关闭。细胞复苏1. 打开水浴锅升温到37°。2. 从液氮罐内取出一支细胞，在表格上登记好。3. 用镊子夹住冻存管，在37。水浴锅内轻轻晃动，直至完全融化。4. 在T25细胞瓶内加入5ml培养基，再吸取融化的细胞液，轻轻滴加入到细胞瓶培养基中。5. 盖好细胞瓶盖，轻轻将液体晃动均匀，在显微镜下观察细胞数量，放培养箱培养。6. 第二天，弃去含DMSO的旧培养基，HBSS洗2次，加入新培养基继续培养。细胞冻存1. 尽量培养一大批细胞在同一时间冻存，选择生长良好的细胞。准备好室温放置的程序性 降温盒，DMSO (冬天冻住需放水浴锅融化)，冻存管，足够的胰酶，并事先配制20%FBS 的培养基。2. 酒精棉球消毒后打开细胞瓶盖子，弃旧培养基，HBSS洗1-2次，加入适量胰酶铺匀，放 培养箱消化。3. 在显微镜下观察，待细胞圆缩，细胞间空隙明显，弃胰酶，加入培养基吹打，直至细胞 全部吹落，成单个分散悬液。4. 将细胞悬液加入离心管离心，2000rpm,10min。弃上清，加入20%FBS培养基吹打混匀， 计数后，加20%FBS培养基调整细胞浓度到10"6/ml，最后加入10%DMSO。5. 分装细胞液到冻存管，每支1-1.5ml。分装完毕转入程序性降温盒，放-80。冻存。过一 天后放入液氮罐冻存。冻存后需取出一支检查细胞整体冻存情况。细胞传代1. 打开水浴锅，放入培养基，并将细胞培养瓶，胰酶等放入安全柜，打开紫外照射半小时。2. 半小时后，打开安全柜照明取出预热的培养基放入安全柜，细胞瓶和试剂瓶口都用酒精 棉球消毒擦拭。3. 打开盖子，弃旧培养基，HBSS洗1 -2次，加入1 ml胰酶铺匀，放培养箱消化。4. 在显微镜下观察，待细胞圆缩，细胞间空隙明显，弃胰酶，加入培养基吹打，直至细胞全 部吹落，成单个分散悬液。5. 按情况将细胞悬液分瓶，放培养箱培养。常用细胞消化时间表细胞种类加胰酶大约消化时间(min)Hep-21-3RD1-3Vero3-10Veroslam10-30veroE61-5MRC51-3BHK211-3C6/36不加胰酶用培养基轻轻吹下MDCK10-30细胞铺板1. 取出一瓶长满的细胞，弃旧培养基，HBSS洗1-2次，加入血胰酶铺匀，放培养箱消化。2. 在显微镜下观察，待细胞圆缩，细胞间空隙明显，弃胰酶，加入培养基吹打，直至细胞全 部吹落，成单个分散悬液。3. 用如果是生长迅速的细胞，用2/3瓶细胞铺1整块孔板，如果是生长较慢的细胞，用整瓶细胞铺1整块孔板。需要接种病毒的孔板需一个孔隔一个孔加入细胞液，所以一般用半瓶细胞液铺板。（加96孔板时候可用槽和排枪）常用细胞由普养瓶参数表细胞瓶面积（cm2）容量（ml）工作体积（ml）细胞数目12.52525X 10 5255051X10 63575102X10 675250154X 10 6150700401.1X107常用细胞孔板参数表细胞板种类每板细胞数每孔加液量6孔板1.2X10 65ml12孔板5X 10 53ml24孔板2.5X10 51-2ml48孔板1.3X10 5800ul96孔板45X10 4100ul常用培养皿参数表培养皿种类每板细胞数35mm1X10 660mm2.6X10 6100mm7X10 6150mm1.8X10 7病毒分离1. 取出一瓶长到70-90%的细胞，弃旧培养基，HBSS洗1-2次，加入含病毒的样本（为培 养液的10%-20%），如果液体不能铺满瓶底，加入少量维持培养基放培养箱。病毒吸附 1-2小时，每隔一段时间晃动瓶子，使液体铺均匀。2. 吸附后，弃液体，加入维持培养基，继续培养。3. 每天观察细胞有无病变或细菌真菌污染，记录情况。4. 如果发生孔板内细菌污染，用枪吸去污染液体，用含氯消毒液反复吹洗干净，以防污染 其他孔。如果发生真菌污染，可用枪吸取液体到EP管，过滤后重新接种细胞。5. 观察到病变明显，细胞脱落，收获培养液体，放-80。冻存。最长观察细胞七天，如果 没有病变，继续盲传观察，3次盲传无病变视作阴性。
