CD8T淋巴细胞在慢性支气管炎与肺气肿大鼠肺血管炎症中作用的实验研究

CD8+T淋巴细胞在慢性支气管炎与肺气肿大鼠肺血管炎症中作用的实验研究【摘要】 目的: 探讨CD8+T淋巴细胞在慢性支气管炎（CB）与肺气肿大鼠肺血管炎症中的分布、 作用以及红霉素（EM）对CD8+T细胞的影响。方法: 将21只健康雄性Wistar大鼠用完全随机设计随机分成3组: A组（正常对照组, n=7）, B组（慢性支气管炎与肺气肿组, n=7）, C组（红霉素治疗组, n=7）。采用2次气管内注入脂多糖（LPS）及烟熏4周的混合刺激方法制作CB与肺气肿大鼠模型, C组同时使用红霉素治疗4周。4周后对大鼠肺脏进行病理形态学检测。结果: B组各大鼠CD8+T淋巴细胞浸润血管比例增多, 肺腺泡内血管外膜CD8+T淋巴细胞浸润增多, 与A组比较有统计学意义（P<0.01）, C组CD8+T淋巴细胞浸润血管比例减少（P<0.01）。血管外膜淋巴细胞、 中性粒细胞浸润减少（P<0.01）, CD8+T细胞浸润减少(P<0.01)。肺血管外膜CD8+T细胞数与肌化型动脉内膜厚度及肺腺泡内肌化型动脉比例呈正相关（P<0.01）。小气道CD8+T淋巴细胞浸润病理积分与肺血管外膜CD8+T淋巴细胞数亦呈正相关（P<0.01）。结论: CB与肺气肿大鼠气道壁及肺腺泡内动脉外膜CD8+T淋巴细胞明显增多, 血管外膜CD8+T淋巴细胞与血管重塑有相关性。EM对慢性支气管炎与肺气肿大鼠气道、 肺血管浸润的CD8+T淋巴细胞及血管重塑有一定的抑制作用。 【关键词】 慢性支气管炎 肺气肿 肺血管 CD8+T淋巴细胞 红霉素我们近期的研究1表明慢性支气管炎（Cronic bronchitis, CB）与肺气肿大鼠在非低氧血症期已出现较明显的肺血管重塑, 在肺腺泡内各型血管外膜可观察到大量的炎症细胞浸润, 以淋巴细胞为主, 本实验在此基础上进一步观察T淋巴细胞亚群在CB与肺气肿大鼠肺血管炎症中的分布特征、 与肺血管重建的相关性, 并使用红霉素(erythromycin, EM)治疗观察其对气道、 肺血管浸润的炎症细胞的干预作用。1 材料和方法1.1 材料及动物模型的建立 健康雄性Wistar大鼠21只（鼠龄12周, 体质量200210 g）, 购自广西医科大学动物实验中心。大鼠随机分为A、 B、 C 3组, 即正常对照组、 CB与肺气肿组、 红霉素治疗组2。A组标准饲养4周, 大鼠可自由进食、 饮水。第1、 14天气管内每次注入9 mL/L生理盐水（NS） 0.2 mL, 每天放入0.22 m3有机玻璃（1.0 m×0.55 m×0.40 m）舱内2 h, 但不予吸烟。B组第1、 14天气管内每次注入脂多糖（LPS） 0.2 mL, 每天在0.22 m3有机玻璃舱内烟熏2 h (每次5支, 30 min/次, 共20支, 第1、 14天除外), 连续4周。用YHL1智能测氧仪（中国航天科技集团公司七三研究所）监测舱内氧浓度使其保持在210 mL/L, 玻璃舱有小孔与外界相通, 保持常压状态, 舱内放置无水氯化钙及钠石灰吸收水分和二氧化碳, 大鼠可自由进食, 饮水。C组第1天起用EM（桂林集崎制药厂）灌胃治疗50 mg/（kg·d）直至动物处死, 共4周, 余条件同B组。羊抗鼠单克隆CD8抗体购自Santa Cruz公司; 鼠抗鼠单克隆CD4抗体购自Chemicon公司; SP试剂盒、 DAB购自迈新生物技术公司。1.2 方法1.2.1 动物血气分析 所有Wistar大鼠在模型制备完成24 h内用10 mL/L戊巴比妥（3050 mL/kg）腹腔麻醉后抽取左颈总动脉血0.5 mL, 置于4冰箱内保存, 2 h内测定。1.2.2 肺组织标本制备及处理 右肺下叶以100 mL/L中性甲醛固定24 h, 于右肺下叶距肺门23 mm处取材, 连续切片, 分别行维多利亚蓝VG染色、 HE染色; 另外制备防脱切片做免疫组化染色。1.2.3 气道炎症病变观察及评分方法 在HE染色下, 根据Cosio等3设计的小气道病变评估方法和标准加以改进。选取直径在7001200 m（管腔最短径/最长径0.7）的膜性细支气管。病理评分方法: 无病变（0分）; <1/4为轻度异常（1分）; 1/41/2为中、 重度异常（2分）; >1/2为重度异常（3分）。 炎症细胞浸润: 无病变（0分）; <10个/Hp为轻度异常（1分）; 1020个/Hp为中、 重度异常（2分）; >20个/Hp为重度异常（3分）。累加每一指标得分, 将累加分占该标本内所有被检的膜性细支气管可能得到的最高分的百分数, 作为该标本膜性细支气管这一指标的病理积分, 把9项指标的病理积分相加, 即可得到每一标本膜性细支气管的病理得分（每项病理指标的最大得分为100分, 9项指标最大病理总分为900分）。1.2.4 肺气肿评分 按照柴秀娟等4介绍的方法计算每例大鼠平均肺泡面积（m2）。对每一例大鼠边缘肺组织任选5个20×镜下视野一定视场面积（275941.9 m2）, 计数每个视场面积肺泡数目（n）, 平均肺泡面积视场总面积（275941.9×5）/肺泡总数（n1+n2+n3+n4+n5）。1.2.5 肺腺泡内肌化型血管外膜浸润炎症细胞计数 在HE染色下, 用DMR+Q550病理图像分析仪（德国）及Leica Qwin分析软件在40×高倍镜下测量肺腺泡内肌化型动脉外膜面积（血管外弹力膜至致密结缔组织边缘）, 在油镜下计算其外膜炎性细胞总数及分类, 以每mm2血管外膜面积中各炎性细胞的数量作为肺血管炎症的定量指标。1.2.6 肺腺泡内病理图像分析 在维多利亚蓝VG染色下弹力纤维呈蓝黑色, 平滑肌显色为棕黄色或棕红色, 胶原纤维显色为红色。用DMR+Q550病理图像分析仪及Leica Qwin分析软件分析大鼠整个切片肺腺泡内小动脉（包括呼吸性细支气管、 肺泡管及肺泡水平上的小动脉）, 根据肺腺泡内动脉显微结构特点将其分为三型: 肌型动脉(MA): 具有完整的内外弹力层及完整的平滑肌层; 部分肌型动脉( PMA): 具有完整的外弹力层, 但平滑肌层和内弹力层不完整; 非肌型血管(NMA)仅有一层弹力层而无明显的平滑肌层。在40×高倍镜下对50 m<直径<150 m的具有完整内外弹性膜的肺腺泡内肌型动脉进行图像分析, 测定其血管外径、 管腔面积、 内膜面积、 管壁面积和血管总面积, 及管腔、 内膜及管壁面积各自所占血管总面积的百分数, 并计算出均数, 作为大鼠肺腺泡内肌型动脉管壁结构重建的定量观察指标。并计数每张切片肺小血管中MA、 PMA及NMA的数目, 分别计算它们占三型血管总数的百分比。1.2.7 免疫组化 采用链菌素亲生物素过氧化酶（SP）法染色。石蜡切片常规脱蜡至水, 高压热修复90 s, 30 g/L过氧化氢室温孵育10 min, 以消除内源性过氧化物酶活性, 蒸馏水冲洗, PBS浸泡5 min, 正常山羊血清室温孵育10 min以封闭非特异性反应。滴加1100稀释的羊抗鼠单克隆CD8抗体或1100稀释的鼠抗鼠单克隆CD4抗体4过夜, 随后加入即用型生物素标记的二抗, PBS冲洗后, 加入即用型链霉素抗生素蛋白过氧化酶溶液, 均各室温孵育10 min后, 使用DAB显色, 苏木素复染, 1 mL/L盐酸酒精分化, PBS冲洗返蓝。以PBS代替一抗为阴性对照。显示阳性反应为胞质呈棕褐色。使用病理图像分析仪观察气道和肺腺泡内动脉外膜CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞浸润的肺血管。1.2.8 统计学分析 使用SPSS11.0统计学软件进行数据分析, 实验数据以x±s表示, 3组间差异比较采用单因素方差分析（One WayANOVA）, 遵循正态分布、 方差齐者组间两两比较采用LSD法分析, 方差不齐者采用GamesHowell法。分析相关性采用直线相关分析。2 结果2.1 气道病理炎症观察和评分 B组大鼠气管、 支气管纤毛黏连、 倒伏、 缺失, 上皮细胞变性坏死糜烂脱落, 气道管壁黏膜充血水肿; 管壁伴有淋巴细胞、 巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞浸润, 使用红霉素治疗后, 气道病理积分下降（表1, 图1）。表1 气道炎症病理积分（略）aP<0.05, bP<0.01 vs A组; dP<0.01 vs B组.2.2 平均肺泡面积 B组肺泡腔不规则扩大, 部分充血水肿增厚, 部分肺泡间隔变薄、 断裂, 相互融合形成肺大泡。平均肺泡面积(3830.77±327.72) m2。与A组面积(2736.04±131.87) m2, C组面积(5554.90±786.92) m2比较差异均有统计学意义（P<0.01）。2.3 血气分析 B组的氧分压、 血氧饱和度比A组轻度降低 (P<0.01), B组的二氧化碳分压与A组比较轻度升高（P<0.01）, C组各项指标均改善, 较B组比较差异有统计学意义（P<0.01, 表2）。表2 动脉血气分析结果（略）bP<0.01 vs A组; dP<0.01 vs B组.2.4 肺腺泡内动脉炎症反应 HE染色在油镜下观察肌化肺血管外膜炎症细胞, B组血管外膜中性粒细胞、 淋巴细胞增多, 以淋巴细胞增多为主, 与A组比较有统计学意义（P <0.01）, C组淋巴细胞、 中性粒细胞下降, 与B组比较有统计学意义（P<0.01, 表3, 图2）。表3 肺腺泡内肌化血管外膜的炎症细胞计数（略）bP<0.01 vs A组; dP<0.01 vs B组.图1 气道炎症的病理学改变 （HE, 免疫组化, ×10）（略）A: 正常组肺泡气管结构; B: 模型组细支气管壁大量炎症细胞浸润; C: 红霉素治疗组支气管壁炎症较模型组减弱, 但仍较正常组多(A、 B、 C为HE染色); D: CD8+T细胞mAb免疫组化染色示气道壁即有较多的阳性细胞表达（棕褐色颗粒）, 其他非阳性细胞胞核经苏木素染色后呈蓝色; E: CD4+T细胞mAb免疫组化染色示气道壁有阳性细胞表达（棕褐色颗粒）, 其他非阳性细胞胞核经苏木素染色后呈蓝色.免疫组化染色下用光学显微镜观察切片肺内所有血管, B组CD8+T淋巴细胞所浸润的血管比例较A组增多（48.55±6.86）% vs （12.42±4.23）%, P<0.01, C组比例（32.52±5.36）%有所下降, 与B、 A组比较均有统计学意义（P<0.01）, 免疫组化染色下用病理图像分析仪观察肺腺泡内肌化型动脉外膜浸润的CD8+T细胞及CD4+T细胞并进行计数（表4, 图2）。2.5 肺腺泡内动脉结构的改变 B组MA内膜增厚、 管腔面积减小、 管壁增厚, MA、 PMA比例增高, NMA比例降低, 与A组比较差异均有统计学意义（P<0.01）, 上述改变在C组均有改善, 内膜面积减少、 管腔面积扩大及MA、 PMA比例与B组比较差异均有统计学意义（P<0.05, 表5、 6, 图3）。表4 T细胞亚群计数（略）aP<0.05, bP<0.01 vs A组; dP<0.01 vs B组.图2 肺腺泡内动脉病理学改变（HE, 免疫组化, ×40）（略）A: 正常组血管结构; B: 模型组血管壁大量炎症细胞浸润; C: 红霉素治疗组血管壁炎症较模型组减弱, 但仍较正常组多(A、 B、 C为HE染色); D: CD8+T细胞mAb免疫