应用SSAP技术分析渐渗系后代多样性研究毕业论文
本科生毕业设计(论文)中文题目 应用SSAP技术分析渐渗系后代多样性研究 外文题目 SSAP technique analysis of diversity in offspring introgression lines 学号0907040010 姓名 陈志青 学院 生命科学学院 专业 生物科学（师范类） 指导教师 罗向东 完成时间2013年4月18日 江西师范大学教务处制目录目录I摘 要2Abstract3引 言41 文献综述5 1.1 植物渐渗杂交的研究进展51.1.1渐渗杂交概述51.1.2 渐渗杂交可激活沉默的转座元件5 1.2 植物逆转座子的研究进展51.2.1 逆转座子的类型与结构61.2.2 逆转座子的转座活性71.2.3 逆转座子的转座机制7 1.3基于逆转座子的SSAP分子标记7 1.4 SSAP分子标记的应用8 1.5本课题的立项依据和研究意义92 材料与方法9 2.1供试材料10 2.2 实验方法102.2.1 模板DNA的制备102.2.2 基因组DNA酶切112.2.3连接接头112.2.4 预扩增122.2.5 选择性扩增122.2.6 扩增产物的检测142.2.6.1 变性聚丙烯酞胺胶电泳142.2.6.2 SSAP条带的显色14 2.3 数据统计153 结果与分析15 3.1 遗传多样性分析15 3.2 群体PCA分析16 3.3 系统进化树分析164 讨 论17参考文献19附录A21 A.1 主要实验仪器21 A.2主要试剂21符号表22致谢23I摘 要逆转座子的高拷贝数特点和稳定的遗传特性使其在分子标记领域有着巨大的应用潜力,高等植物中的逆转座子主要属于Ty1-copia类,基于其LTRs的SSAP已成为最有用的分子标记技术之一。本研究利用本实验室分离到的东乡野生稻渐渗系后代Ty1-copia类逆转座子的LTRs,建立了研究东乡野生稻渐渗系后代多样性的SSAP技术。对46个材料包括东乡野生稻渐渗系、中国栽培稻以及国外栽培稻进行遗传多样性分析。SSAP序列特异性引物根据Ty1-copia类逆转座子houba、osr15和osr17的LTR区域设计。结果扩增得到140条条带，进一步分析可以将这些条带分为6个家族,东乡野生稻后代几乎分布于每个家族中; PCA分析也发现, 东乡野生稻渐渗系后代分布广泛。渐渗系后代的平均Nei's基因多样性（He）结果为0.394,高于中国和国外的栽培稻（分别为0.385和0.376）。表明渐渗杂交能够扩大现有栽培稻的变异度,为水稻遗传改良提供有效的途径。关键词：渐渗系，栽培稻，SSAP，多样性 SSAP technique analysis of diversity in offspring introgression Chen ZhiqingDirected by Professor Luo Xiangdong AbstractThe stable of genetic characteristics and high copy number of retrotransposons made it has great potential applications in the field of molecular markers, retrotransposons in higher plants are mainly belongs to the Ty1-copia class, The SSAP based on LTRs has become one of the most useful molecular marker technology.This study use the LTRs of offspring introgression lines derived from Dongxiang wild rice , it is the class of Ty1-copia retrotransposon which was separated in our laboratory, established the study of SSAP technology of the diversity of Dongxiang wild rice introgression lines.46 materials including introgression lines (ILs) derived from Dongxiang Wild Rice and cultivated rice from China and Foreign were used to investigate the genetic diversity by using SSAP technology. The SSAP primers were designed according to the LTR region of Ty1-copia like retrotransposon (houba, osr15 and osr17). The result showed that a total of 140 sepecific bands were amplified. Six families were distinguished after cluster and alignment analyses of the bands. ILs derived from Dongxiang Wild Rice exsit in all of the families. The average Nei's gene diversity (He) of ILs was 0.394, which was higher than that of China and Foreign cultivated rice (0.385 and 0.376, respectively). It suggested that introgression hybridization introgression could broaden the base of genetic variation and provided a method in breed improvement of rice. Key words: introgression lines, Cultivated rice,SSAP,diversity引 言人们在对植物遗传多样性诱发因素的深入研究中发现了大量存在于高等植物的逆转座子(Retrotransposon)，它是目前己知数量最大的一类可活动的遗传因子，根据逆转座子DNA序列中是否含长末端重复序列(Long terminal repeat ,LTR)及其结构特点，可将逆转座子分为LTR和non-LTR两类1。 高等植物中的逆转座子主要是LTR类，其拷贝数、结构、插入位点对基因组大小及遗传多样性具有重要的意义。在过去十年, 研究者开发了各种各样的分子标记用于研究LTR逆转座子的插入位点, 如序列扩增多态性(SSAP)。序列SSAP技术是基于AFLP技术的基础上改进的, 能够识别出逆转座子插入位点及其附近序列的多样性，由于其多态性比例高、更适用于逆转座子家族拷贝数分析而被广泛应用。这种方法已经应用于各种植物的遗传图谱构建、基因多态性分析、系统进化树构建、植物进化研究以及由逆转座子导致的基因功能改变分析2。前人的研究表明,外源DNA渐渗能够导致植物基因组中逆转座子结构、拷贝数以及活性的改变3，而逆转座子活性的改变会使其在基因组DNA上的插入位点发生改变，进而引起植物基因组大小以及遗传多样性的改变。东乡野生稻具有许多优异基因，但其渐渗过程中会导致许多遗传和表观遗传上的改变4，如染色体结构的变异、序列的丢失和出现、以及LTR逆转座子活性的改变。而逆转座子活性的改变对其渐渗系后代群体的多样性也将产生变化,本研究利用SSAP技术,与栽培稻作为参照，对东乡野生稻渐渗系后代的遗传多样性进行探究。研究结果发现东乡野生稻渐渗杂交能够扩大现有栽培稻的变异度,同时也为水稻遗传改良提供有效的途径。1 文献综述1.1 植物渐渗杂交的研究进展1.1.1渐渗杂交概述渐渗杂交(Introgressive hybridization)最早由Anderson和Hubricht5所定义，指两物种的杂交后代与亲本反复回交，把某一亲本的性状带至另一亲本，产生的后代称为渐渗系。许多植物的进化历程中都含有渐渗杂交的足迹。在水稻的渐渗杂交中，育种工作者构建了水稻与多种野生稻的种间渐渗杂交后代, 主要利用了野生物种的抗逆性、抗病虫性、株型、耐光氧化、C4 植物的高光效和抗光氧化等优异基因。本研究利用东乡野生稻和栽培稻协青早B构建渐渗系进行了渐渗系后代遗传多样性研究6。这些渐渗系的构建及优异基因的研究为有效的利用外源优异基因进行作物遗传育种奠定基础, 对于创造新的水稻种质具有重要理论意义。1.1.2 渐渗杂交可激活沉默的转座元件在植物和真菌基因组中, 转座元件多数情况下是处于抑制状态7。几十年前，McClintock就曾预言，渐渗杂交对植物基因组来说是一种强烈的“冲击”(genome shock)，在这种情况下，基因组内沉默状态的转座元件被激活，从而对这一冲击发生反应并引起基因组的重建。尽管尚缺少渐渗杂交和转座元件激活之间因果关系的直接证据，但一些间接的观察得出的结论与McClintock的预言相一致，而且越来越多的研究也支持这一假说。研究表明，菰DNA渐渗杂交能够引起水稻基因组中几种LTR逆转座子拷贝数的增加以及MITE类转座子mPing和Pong的激活8；小麦族远缘杂交及多倍化可激活转座子元件、蛋白质编码序列以及一些未知功能的序列9；两种烟草Nicotiana otophora和N. tabacum的种间杂交、两个wallaby种间杂交等植物的研究都能够为种间杂交激活沉默的转座元件提供有力的证据。总之，从以上研究可以看出，远缘杂交可激活基因组中沉默的转座元件，这很可能是远缘杂交打破了基因组内部表观遗传抑制控制（如甲基化状态的改变）的结果。1.2 植物逆转座子的研究进展 转座元件（Transposable element, TE）是指在植物基因组中从染色体的一个位点转移到另一位点或者从一条染色体转移到另一个染色体上的DNA 序列10。根据其结构和转座机制不同，转座元件可分为两个主要类型：第一类以RNA为中间媒介通过DN
