病毒学技术-病毒的培养

病毒学技术病毒学技术病毒的培养病毒的培养实验动物二、鸡胚三、组织培养(一)器材准备(二)洗液和溶液(三)营养液(四)组织和细胞的培养方法(五)细胞克隆技术(六)细胞的保存四、病毒的组织培养五、病毒蚀斑技术主要参考文献HTFL)HT5SS病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从 50 年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。HT4HJZ一、实验动物HT5SS实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(GermFreeAnimal,简称 GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics,简称 GN)和无特定病原动物(SpecificPathogenFreeAnimal,简称 SPF)。GF 动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。GN是确知所带微生物的动物。只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。SPF 是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。从微生物控制的程度讲,SPF 动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。限于条件,某些实验室当前仍常应用普通实验动物,但也必须健康,并使用纯系品种。一次实验使用的动物,在年龄、体重和营养状态等方面要尽量一致。国外实验动物科学发展迅速,我国已在部分大城市建立实验动物中心,专供应各种经过人工遗传控制和微生物控制而育成的纯系高品位实验动物。为了满足生物学、医学和兽医学研究的需要,国外按遗传控制标准已育成各类实验动物 2600 余种,其中小鼠就有 1700 余个品系,而且已经规范化、标准化,从而保证了研究工作的科学性和严密性。虽然病毒学实验中应用实验动物的比重正在逐步降低,但是乳鼠至今仍是分离某些虫媒披膜病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒的主要工具。兽医学上除常应用家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠和鸡胚等进行病毒分离、驯化以及疫苗生产以外,还常直接应用自然易感动物,例如羊、猪、狗、鸡甚至马和牛等大动物作各该病毒的实验研究。但如上述,普通实验动物经常自身带毒,甚至发生病毒病的流行。例如家兔常有乳头状瘤、多型瘤、疱疹、兔痘、脑脊髓炎和传染性口腔炎等病毒感染,小白鼠常有鼠痘(脱脚病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、病毒性肺炎、脑脊髓炎、白血病、乳腺瘤、鼠肝炎等病毒感染,仓鼠有唾腺炎等病毒感染,豚鼠有脑膜炎、唾腺炎等病毒感染,实验研究时必须注意。实验动物主要用于:(1)分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒;(2)培养病毒,制造抗原和疫苗;(3)测定各毒株之间的抗原关系,例如应用实验动物作中和试验和交叉保护试验;(4)制备免疫血清和单克隆抗体;(5)作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定,建立病毒病动物模型等。进行动物实验时,首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和品系,以及适宜的接种途径和剂量。至于实验动物的饲养管理、接种和采血、剖检等具体方法,请参阅微生物学实验指导或有关专著。JZHT4H二鸡胚HTHT5SS鸡胚(包括其它禽胚)是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母鸡垂直传递的病毒,如禽白血病病毒以及新城疫、禽脑脊髓炎和 Rous 肉瘤病毒等。另外,胚胎中往往含有因母鸡免疫而产生的卵黄抗体,影响同种病毒的增殖。因此理应选用 SPF 鸡群产的蛋。虽然喂饲添加抗生素饲料母鸡的蛋中含有抗生素,但对病毒学实验通常无影响。病毒在鸡胚中增殖,除部分病毒产生痘斑、引起充血、出血、坏死灶和死亡等变化外,许多病毒缺乏特异性的感染指征,必须应用血清学反应或检查病毒抗原以确定病毒的存在。鸡胚实验必需的器械主要有孵卵箱、检卵灯、卵盘、开卵钻、卵杯和羊膜腔接种用的照明灯等。操作时要注意防止污染,选择适宜的接种途径和培养温度,并要认真观察,及时收获。鸡蛋孵育前不要洗擦,因洗擦能除掉卵壳表面的胶质保护层,容易致发细菌感染。没有孵卵箱时,也可用普通恒温箱代替,为保持 40%70%的相对湿度,于其下部应放一盛水盘。最适温度为 3839,并应每天翻卵 12 次。现扼要介绍常用的绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊和羊膜腔等四种接种方法(图 11-1)。JZ图 11-1鸡胚接种的途径HT5H1.绒毛尿囊膜接种HT5SS主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖,这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。用1012 日龄鸡胚,在胚胎附近略近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器在卵壳上烙出一个直径约 34mm 的烤焦圈,用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵壳,造成卵窗,但不可损伤壳膜。在气室端中央也钻一个小孔。随后用针尖轻轻挑破卵窗中心的壳膜,切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。滴加 1 滴灭菌生理盐水于剌破处。用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气,造成气室内负压,使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室,此时可见滴加于壳膜上的生理盐水迅速渗入。用 1ml 注射器滴入 23 滴接种物于绒毛尿囊膜上。最后用透明胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗上,周围涂以熔化的石蜡密封之。气室中央的小孔可用石蜡密封住。鸡胚在接种后,横卧于孵卵箱中,不许翻动,保持卵窗向上。绒毛尿囊膜接种的另一种方法是在气室端的卵壳上开约 15cm×15cm 的口,并小心地用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜,切勿损伤其下的绒毛尿囊膜,随即滴入接种物,最后用透明胶纸封闭开口。HT5H2.尿囊腔接种HT5SS主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖,也是制备马脑炎病毒疫苗的常用接种途径。选用 1011 日龄的鸡胚,画出气室和胚位,在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精进行消毒后,用钢锥穿一小孔,随后将注射器针头沿此小孔插入 0510cm 处(避开血管),注入 0102ml 接种物。最后用石蜡封口,并置孵卵箱中孵育。每天翻卵并检卵一次。24 小时内死亡者废弃。但如上述,东方型和西方型马脑炎病毒常可在接种后的 1524 小时内致死鸡胚。另一个方法是在胚位附近没有血管处穿孔并注入接种物,但此时必须将气室端稍向下倾,否则接种液甚至尿囊液可能从针孔中回溢出来。蜡封的方法同前。HT5H3.卵黄囊接种HT5SS主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。用 68 日龄鸡胚,画出气室和胚胎位置后,垂直放置在固定卵座上,用碘酊和酒精消毒气室端,以钢锥在气室中央锥一小孔,用灭菌注射器吸取含病毒悬液,沿气室端所穿小孔剌入约 3cm,注入 0105ml 接种物于卵黄囊内。随后用溶化的石蜡封孔,置孵卵箱内继续孵育,每天翻卵 12次。24 小时内死亡者废弃,但东方型和西方型马脑炎病毒可能在接毒后 1524小时内致死鸡胚。4.羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。在由病料初次分离病毒时,羊膜腔接种法比尿囊腔接种法敏感。但此法操作技术比较困难,鸡胚也易受伤致死。选用 1112日龄的鸡胚,按绒毛尿囊膜接种法造成人工气室,撕去卵壳,并剌破绒毛尿囊膜血管较少的部位,用钝端镊子沿此破孔插入,夹起羊膜囊,注入 0102ml 接种物。由于不易判断接种物是否被正确地注入羊膜腔内,故可将已经吸取了接种物的注射器的筒栓稍微回抽,使注射针芯内含一个气泡。注射时将气泡和接种物一起注入。将卵适当倒转,即可清楚地看到气泡是否在羊膜腔内,以判定注射是否正确。另一个方法是在气室端中央开一个 12cm 直径的圆孔。用灭菌镊子揭去卵窗部位的卵壳和壳膜,并滴加 1 滴灭菌液体石蜡于内层壳膜上,使其透明。如置检卵灯上观察,看得更加清楚。随后用灭菌弯头眼科镊子,剌破内层壳膜和绒毛尿囊膜(避开血管!)并轻轻夹起羊膜使成伞状,并在直视下将注射针头插入羊膜腔内,直到碰着鸡胚或看到胚胎突然向后退缩,证明针头已经到达羊膜腔内,即可进行接种。接种病毒后的鸡胚,一般放 37孵育,也有少数病毒如流感病毒则放置于 3335。除接种马脑炎病毒外,在 24 小时内死亡的鸡胚均视作非特异死亡而废弃。培养时间也随病毒种类而异(参见病毒各论)。根据接种途径的不同,收获相应的材料:绒毛尿囊膜接种者,收获接种部绒毛尿囊膜并注意观察病变;尿囊腔接种者,收获尿囊液(58ml),并于收获前将鸡胚直立放置于 4冰箱半小时以上,冻死胚胎,防止出血;卵黄囊接种者,收获卵黄囊或胚体;羊膜腔接种者,收获羊水(051ml)。兽医病毒学实验中,除常用鸡胚外,有时也用鸭胚、鹅胚、火鸡胚和鹌鹑胚等进行病毒分离、弱毒株培育、疫苗制造以及卵黄抗体生产等。鸭和火鸡的孵化期为 28 天,比 21 天孵化期的鸡胚更有利于慢病毒的增殖。实验动物和鸡胚在病毒学上的主要用途请见表 11-1。JZHT4H三组织培养HT组织培养,原来是指动物或植物组织小块的体外培养。这个名称现在用以泛指体外的组织、器官和细胞培养,是分离和培养病毒以及进行病毒学实验研究的简便而有效的工具和手段。病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用,可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。近年来,许多新的动物病毒,就是通过组织培养方法而被发现。生产病毒抗原以及制造病毒疫苗,则更大量地应用着组织培养。组织培养的方法有三种。HT5H1组织(块)培养HT这就是原来意义上的所谓组织培养。将动物组织切成小块在固定或悬浮状态下培养。组织块培养是最早的组织培养方法。HT5H2器官培养HT取器官薄片(例如一段胎儿气管或一小块鼻粘膜)进行培养,使其基本保持原来的结构和功能,例如正常的纤毛上皮运动。某些呼吸道病毒,就是应用器官培养才分离出来的。这种培养还是研究器官生理机能以及某些病毒感染机理的良好工具。HT5H3.细胞培养HT应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液,适当洗涤以后,加入营养液,通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上,并生长增殖。这样的细胞培养物称作ZZ4原代细胞。将已长成单层的原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来后再作培养,就是ZZ4继代细胞。原代细胞和继代细胞一般地还保持原来细胞主要特性,例如继续保持正常体细胞二倍体组型的染色体等。经过严格检查,染色体的数目和形态正常,并且没有污染的继代细胞,特称ZZ6二倍体细胞株。继代细胞(包括二倍体细胞株)一般可在体外传几代、几十代至一百代左右,此后不可避免地逐渐衰老死亡。由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现恶性变细胞,也就是癌变细胞。这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能,而且几乎