HPLC故障及排除方法

HPLC 故障及排除方法诊状  可能的原因及 解 决 方 法  (一)保留时间变化1.柱温变化                                   柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡                   至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够                             用>25mmol/L的缓冲液 4.柱污染                                     每天冲洗柱 5.柱内条件变化                               稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命                               采用保护柱 (二)保留时间缩短1.流速增加                                   检查泵,重新设定流速 2.样品超载                                    降低样品量 3.键合相流失                                流动相PH值保持在37.5检查柱的方向 4.流动相组成变化                             防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加                                   柱恒温 (三)保留时间延长1.流速下降                                  管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化                 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失                               同前(二)3 4.流动相组成变化                            同前(二)4 5.温度降低                                 同前(二)5 (四) 出现肩峰或分叉1.样品体积过大                      用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强                       采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道               更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效                 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏                         更换进样器转子 (五)鬼峰1.进样阀残余峰                      每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物                       处理样品 3.柱未平衡                     重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)                 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相)                                 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 (六) 线噪声1.气泡(尖锐峰)                                流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声)                              清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.检测器灯连续噪声                  更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声)                           采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡                    流动相脱气,加柱后背压 (七)峰拖尾1.柱超载                         降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰                          清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用                      加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 4.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 5.柱效下降                         用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)峰展宽1.进样体积过大                        同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展                 进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢                 设定速率应是每峰大于10点 4.检测器时间常数过大                   设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 5.流动相粘度过高                       增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大                       用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长                         等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大                         将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载                             进小浓度小体积样品关于基线漂移的几点看法   在实际工作中，我们经常能遇到基线的漂移的情况。关于基线漂移（或上下波动）的原因，可能有以下几种：   1：柱子的平衡时间长。一般来说，新柱子的平衡时间要短。有些老柱子的平衡是时间长。当然，柱子的平衡是时间也和它使用的流动相有关系。如果使用了离子对试剂，那么比普通的简单的流动相（例如 二元流动相：甲醇：水，乙腈：水，）   2：系统存在漏点。如果系统存在漏点，那么出现基线向下漂移。需要检漏   3：PUMP头有气泡。PUMP头的气泡会导致基线的漂移和波动。如果怀疑是PUPM头有气泡导致基线不稳，只需要看仪器的压力是否稳定就好。   4：流动相脱气。如果流动相没有脱气，基线肯定是不稳的   5：柱后气泡。在柱子后有气泡产生，导致检测器中的读数有波动。   6；PUMP密封不好。密封不好，也会导致PUMP头的气泡（好象不可能）和漏夜，基线当然不稳定了。   7：系统的环境。仪器的使用，如温度的变化，流速的变化，以及梯度洗脱，当然基线漂移   8：单向阀睹塞或污染。单向阀的睹塞和污染，能造成流量不准确，压力 波动。故也会波动，漂移   9：检测器污染或有杂质另外，偶前几天看书的时候发现还有一说法：检测波长不在最大检测波长的时候也会出现基线漂移，偶百思不得其解？为什么会这样？按道理来说，如果检测波长不是某物资的最大吸收，那么它对该物质的灵敏度也不是最大的，则信号的变化也不可能大于在最大吸收波长时的高灵敏度的信号变化。所以偶认为在某物质的非最大吸收波长条件下检测，应该基线更稳定。当然，可能在这样的波长的情况下，别的非目标物质的吸收会比较灵敏，造成了基线的不稳定（偶想可能在着是一个最好的，也比较合理的解释了）   现在来说说我工作中的实际情况吧。  昨天做加样回收率，都做了好几个。基线一直很平稳。突然在进样某一浓度后，基线向下漂移。一直的向下飘。大家可以看看偶的前后两张谱图。图1图二当时，偶做了以下几项工作：1 检查是否漏夜。仔细的检查了每一个接口，发现没有漏夜。2 观看压力是否波动。发现有稍微的波动，打开放空阀，大流量的排气后再观察。基线还是漂移。3 给仪器装一个负压装置（在废液出口处加一微孔过滤头）。4 换流动相。把三元流动相换成二元的流动相结果都没有解决问题：基线还是漂移（向下，如图1）。检测器偶在前不久拆下清洗过，故不存在检测器污染的情况。系统环境也算还可以：温度，湿度，流量等都没有明显的改变。PUMP密封很好（前段时间换了密封圈）。流动相也脱气了啊（前面基线走的好好的）偶就很纳闷，能找的原因都找了。怎么还会这样呢？最后一个问题没有找：单向阀污染。偶不知道该怎么清洗。看那说明书看的偶很糊涂：那上面密密麻麻的小部件，偶惧怕把它们拆下来就装不上去了。苦痛ING  昨天晚上，把柱子又冲了很长时间：甲醇-水（50：50） 甲醇， 甲醇-水（50：50），早上起来跑柱子（简单的二元流动相），平衡了3小时，还是是向下漂移。郁闷ING 看来偶只好把单向阀拆下来清洗，看是否能解决问题/期待中ING今天把单向阀拆下清洗一切OK了