高灵敏度激光共聚焦显微镜lsm780快速操作手册-山东大学公共

1 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 高灵敏 度激光 共聚焦 显微镜(LSM780) 快速操作手册快速操作手册 高灵敏度激光共聚焦显微镜 (LSM780) 操作手册(Quick Start Guide) 资产与实验室管理部制资产与实验室管理部制 2 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 目录 一 硬件组成 . 3 二 开机顺序说明 . 4 三 关机顺序说明 . 6 四 软件使用说明 . 8 五 仪器性能和参数 . 66 六 物镜清洁方法 . 68 七 实验数据导出方法 . 69 八 激光安全 . 71 九 显微镜的科勒照明 . 72 十 观察中的常见问题 . 73 3 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 一 硬件组成 4 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 二 开机顺序说明 1 打开稳压电源【编号：1】 ，开关在背面，稍等片刻，待正面的三个指示灯 均变成绿色后，再进行下面的步骤。 2 打开主开关【编号：2】 。 3 打开电脑系统 【编号：3】 。 4 打开扫描硬件系统【编号：4】 。 注：“ON”和“”代表开启 “OFF”和“0”代表关闭 控制激光开关的钥匙一直处于“on”状态，不需对其做任何操作。如果控制激光开关的钥匙处于“off”状态，则打开扫描硬件系统开关【4】后，硬件扫描系统不能启动。 注：当实验需要使用多谱线氩离子激光器 (458nm/488nm/514nm)时，请进行 5、6、7 步骤；当实验不需要时，请跳过这三个步骤，直接按步骤 8 继续开机。 5 打开多谱线氩离子激光器开关【编号：5】 ， “Power”和“Interlock”灯均亮。 6 顺时针旋转钥匙到“”【编号：6】 ， 预热等待约 10 分钟。 7将扳钮由“Standby” 扳至“Laser run”状态 【编号：5 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 7】 ，绿灯亮后，可进行正常使用，旋钮维持在九点钟方向。 8 打开电动倒置荧光显微镜的电源开关【编号：8】 。 9 打开金属卤素灯的开关【编号：9】 。 10 打开 Realtime PC【编号：10】 。绿色指示灯亮，即可进行下一步。 11 打开 ZEN System 主机【编号：11】 ，即开机完成。 6 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 三 关机顺序说明 1关闭软件，退出系统，点击Shutdown，即可自动关闭ZEN System PC【编号：11】 。 2 关闭 Realtime PC【编号：10】 。 3 关闭金属卤素灯【编号：9】 。 4 关闭电动倒置荧光显微镜开关【编号8】 7 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 注：如果开机时启动了编号5,6,7开关，则进行以下关机步骤，否则直接进行第8项 5 将扳钮由“Laser run” 扳至“Standby”状态【编号：7】 。 6 逆时针旋转钥匙到“O”，等待约10分钟【编号：6】 。 7 等风扇停止后（声音明显减小） ，即可关闭多谱线氩离子激光器 【编号：5】 。 8 关闭扫描硬件系统【编号：4】 。 9 关闭电脑系统【编号：3】 。 10 关闭主开关【编号：2】 。 11 关闭稳压电源【编号：1】 。 8 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 四 软件使用说明 1 电脑开机进入操作界面后，在预约 的时间段内登录，用户名和密码与预约 系统相同。 2 双击桌面上的 ZEN 图标。 3 进入ZEN 界面后，弹出对话框，有如下两个选项，根据需要进行选择： “Start System”初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等，大约需要等待40秒。 “Image Processing”不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。 软件启动过程中会进行显微镜及扫描头部分的自检，所以在启动期间，请不要移动物镜或荧光模块等元件，以避免自检时报错。点击Boot Status前的三角形按钮，打开隐藏的对话框，可以显示软件启动时9 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 的自检过程。 4 软件界面 常规的方法是首先将光路切换到眼睛进行观察，并将选定的目标移到视野中心位置；其次将光路切换到检测器，先对拍摄参数进行调节，后拍摄图像；最后对获得的图像进行编辑和保存。Ocular主页面：可以控制显微镜部分的电动元件，方便用户完成样品观察。Acquisition主页面：包含了扫描图像所需的各种参数设置。Processing主页面：包含了软件提供的图像处理工具。Maintain主页面：提供了调节Pinhole位置，设置物镜的工具，可以进行简单的系统维护。 打开图片后，在图像的左侧会出现一系列不同的视图窗口。根据图像内容，可提供各通道的单色图像、灰度直方图、荧光共定位信息，3D 重构图像等不同视图。 在打开不同的视图窗口时， 图像下方会显示10 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 相应的视图控制界面，可以通过其中的参数调节视图的显示方式。 在扫描图像时，状态栏中会出现蓝色进度条，及扫描时间提示，待扫描结束后进度条自动消失。 11 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 5 二维图像扫描 (1)目镜下观察样品 将样品固定在样品夹上，注意使盖玻片朝向物镜。启动软件，在左侧工具栏点击Locate，进入相应的主页面，完成目镜下的样品观察。 点击Online按钮，激活软件对显微镜的控制。如需在明场下观察样品，点击透射光观察快捷键，一般名称为BF（Bright Field）或Transmitted Light，也可选择DIC观察模式。 选择合适的物镜，可以在软件中点击物镜控制按钮，从下拉菜单中选择适当的物镜进行观察。也可在显微镜触摸板控制键盘上选择。 如需观察荧光样品，打开fluorescence shutter，选择shutter on，点击反射光观察快捷键， 一般由DAPI， FITC， Rhodamine三种荧光滤片对应的不同荧光波段观察，可根据自己的样品进行选择。 此时的荧光光源为x-cite，激光安全保护装置自动阻断激光、 保护眼睛。 观察完样本后， 关闭fluorescence shutter防止光漂白破坏样本。 12 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 通常会先用低倍物镜找到样品，然后切换到高倍物镜进一步观察。如需换用水镜或油镜，请注意正确滴加相应的介质。调焦时，先在目视下让物镜尽可能贴近样本，然后在通过目镜观察的同时，向远离样品的方向调节，以保证物镜的安全。在目镜下将待扫描区域调节至视野中央，在软件界面中点击Offline按钮，结束观察，软件自动将光路切换至激光扫描部分，荧光光源为激光。 (2) 图像扫描的光路配置 点击Acquisition，打开Acquisition页面，在该主页面中，用户可以完成图像扫描及相应设置。 光路转换大约需要3-5s， 请待光路转换完成后， 再进行下一步操作。为了保护操作人员免受激光伤害，在打开Acquisition主页面后，共聚焦扫描显微镜将自动切断目镜观察光路，用户只能通过软件界面预览或扫描图像来观察样品。 点击左上方的 Smart Setup 按钮， 完成光路配置。Smart Setup 对话框打开后，在Configure your experiment 表格中选择待观察样品所使用的荧光物质及伪彩色。 在 Dye 列表下， 点击三角形按钮，打开 Dye 列表，在 Search中输入荧光物质的英文名称，或直接在 Dyes 列表中查找荧光物质名称。单击选中的荧光物质名称，将其纳入实验设置。 13 显 微 表 征 平 台 The Microscopy Characterization Facility 如果选择多种荧光物质，软件将根据其发射波长自动配置伪彩色。如果只有一种荧光物质，软件则默认显示黑白图像。可以点击Color列表下的三角形按钮，打开Color列表，自定义通道伪彩色。Dye列表中包含了目前商品化的绝大多数荧光染料或荧光蛋白，但如果用户使用的荧光物质没有包含在列表中，可以选择激发光谱和发射光谱近似的物质进行替代。 软件提供四种备选扫描模式： Fastest：在各荧光物质的发射光谱不完全重叠的情况下，同时扫描多种荧光物质， 扫描成像速度在各种扫描模式中是最快的，但不同的通道间可能出现信号串扰。 Best Signal：针对不同荧光物质逐一进行扫描成像，从而尽可能地减少各种荧光物质发射光谱间的串扰，但扫描成像速度会明显降低。 Best Compromise：综合考虑成像速度和信号质量，同时扫描发射光谱重叠较少的荧光物质，在减少信号串扰的前提下，在一定范围内提高成像速度。 Linear Unmixing：进行多通