大黄素对腹腔感染大鼠血浆白蛋白及细胞因子TNFα、IL6的影响

浙江大学硕士学位论文大黄素对腹腔感染大鼠血浆白蛋白及细胞因子TNF-、IL-6的 影响姓名：吴可人申请学位级别：硕士专业：外科学（普外科）指导教师：郑树森20060401浙江大学坝十学位论文大黄素对腹腔感染大鼠血浆白蛋白及细胞因子T N F 、I L 6 的影响浙江大学医学院外科学( 普外科)硕士研究生吴可人导师郑树森院士叶再元教授张勤教授中文摘要目的与背景腹腔感染是外科的常见疾病。在普外科，严重的腹腔感染是引发全身炎症反应综合征( s I R s )或脓毒症的常见原因，一旦发生，治疗非常困难，大大增加了病人的死亡率。在美国每年有7 5 0 0 0 0人罹患严重的脓毒症，其死亡率接近3 0 。目前比较一致的看法是：s l R s 是由感染性或非感染性因素引起的机体持续过度的炎症反席，包括细胞| 蚓子和其他多种炎性介质的大量释放，以及随后的级联放大效应，其中细胞因子尤其受到关注。1 0 多年来，国内外的学者试图在炎症反应的各个阶段进行阻断，以期预防和治疗s I R s 然而临床试验的效果并不理想。人黄属蓼科草本植物，是传统中草药，临床应用已有数千年历史，具有泻下攻积，清热解毒，凉血行瘀之功效。其主要成分有葸醌类，人黄多糖，大黄鞣质等。大黄被认为在治疗s I R s 及多器官功能不全综合征( M o D s ) 等方面有明显效果。大黄素属于大黄葸醌类，作为中药夫黄的主要成分，其抗炎作用也受到重视。在对与S 喂s 关系密切的急性胰腺炎的研究中，刘瑞林等通过动态浙江大学倾士学位论文观察大黄素对急性重症胰腺炎肿瘤坏死网子( T N F “) 、向介素6 ( I L - 6 ) 的作用得出结论，大黄素可以明显抑制细胞因子的释放并减轻急性重症胰腺炎的炎症反应。但大黄素对腹腔感染及其所致脓毒症的影响未见报道。本动物研究根据大黄素的药理作用特点，采用随机对照方法，通过静脉注射给药的方式，比较大黄素作用下大鼠血浆自蛋白、T N F 一、I L 6 及大鼠肠粘膜病理评分等改变，观察人黄素对腹腔感染动物模型的保护和治疗作用，并进步探讨其作用机制。材料与方法1 、实验动物处理健康、性成熟的S p r a g u e - D a w l e y ( S - D ) 大鼠9 0 只，体重1 8 0 2 3 0 9 ，雄性。大鼠由浙江中医学院实验动物中心提供，于该中心以清洁级喂养，投喂标准实验大鼠全价颗粒饲料，自由饮水，采用架式笼养，房内具空调以保持室内温度，集中通风。9 0 只大鼠术前随机分为三组( A 、B 和c 绢) ，每组3 0 只。所有动物术前1 2 小时禁食不禁水，3 戊巴比妥钠溶液按4 5 m g k g 体重腹腔注射麻醉后，固定，腹部各皮消毒，铺无菌孔巾，沿腹正中线作2 c m 切口，暴露盲肠。其中B 、C 两组用丝线结扎二分之一盲肠，避免肠梗阻，用1 8号针头穿刺并挤出少量肠内容物造成腹腔感染。将盲肠放回腹腔，缝合腹部切口。A 组不作盲肠结扎和穿刺，其余步骤同B 、C 两组。术后大鼠自由进食。A 组为假手术组；B 组为大黄素治疗组，术后即刻以大黄素1 0 m g k g 用注射用水稀释成2 m l 尾静脉注射，其后每1 2 h 重复一次：C 组为盲肠结扎穿刺( C L P ) 对照组，术后即刻以注射用水2 m l尾静脉注射，其后每1 2 h 重复注射一次。2 、实验标本及取材每组分别于术后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h ( 每时点l O 只) ，3 戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，固定，开腹，取下腔静脉血后处死，取空肠段约l c m 。大鼠血液静置3 0 m i n 后以3 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 m i n ，取血浆一7 0 “ C 保存。空肠组织以1 0 甲醛同定液同定。3 、实验观察指标及测定1 )实验中常规观察各组大鼠的精神状态、活动情况、进食、大便等情况。2 )血浆白蛋白测定：采用溴甲酚绿法( B C G ) 自动分析测定血浆白蛋白含量。2浙江人学硕士学位论文3 )血浆T N F n 测定：取血浆标本1 0 0 1 L I ，按T 卜J F 一放射免疫分析测定盒的要求测定血浆T N F - a含量。4 )血浆I L ，6 测定：取血浆标本1 0 0 9 l ，按I L 6 放射免疫分析测定盒的要求测定血浆I L 一6 含量。5 )病理组织学检查：取大鼠空肠标本，i o 甲醛固定，石蜡包埋切片，肌染色后用普通光学显微镜观察，并进行肠粘膜炎症损伤病理评分。6 ) 统计学处理：采用S P S S l 0 0 统计软件包，数值变景用牙±S 表示，先进行方差齐性检验。若方差齐，则组间两两比较采用S t u d e n t 。N e w m a n K e u l s 检验。若方差不齐，则通过变量变换使方差齐，再按上述方法进行检验。分类变鼍采用K r u s k a lW a l l i s 检验。结果1 、一般情况：实验过程中9 0 只大鼠均存活。假手术组大鼠精神状态好，食欲佳，活动止常人便正常。盲肠结扎穿刺人鼠手术后大多数出现精神萎靡、活动减少和食欲减退的情况，有逐渐加重趋势。大黄素治疗组大鼠多数有排软便或稀便现象。C L P 对照组大鼠则大便较少或有腹泻，少数大鼠有排淡黄色果冻样便现象。2 、血浆白蛋白的变化：C L P 后3 6 h 大黄素治疗组高于C L P 对照组( P 正常值之上2 个S D ；血流动力学参数：低血压( S B P 4 0 m m l J g ，或年龄正常值之下2 个S D ，心脏指数> 3 。5 Lm i nm2 ：器官功能不全：动脉血氧含蕈过低F i 0 ： 4 4 2 9 m o l L ，凝血异常( I N R > 1 5 或活化凝H ' 寸I ' H JA P T T > 6 0 s ，肠梗阻( 无肠呜音) ，血小板减少 7 0 9 m o l L ) ：组织灌泣参数：高乳酸血症；毛细血管充盈减慢或皮肤出现斑白纹。临床的前瞻性研究资料表明，严重的刨伤、感染、出I f I L 、休克等病人的后期死亡，几乎都经过S I R S 。M O D S M O F 这一共同途径。S I R S 是M O D S 的前奏，M O D S 是失控性炎症的结果。因此，防治各种病因引起的S I R S ，是防治M O D S 、降低危重病患者死亡率的关键，也是干预措施实施的关键。2 、S I R S 的研究进展1 ) S I R S 与细胞因子关丁T N F m 及I L 6 在S I R S 及脓毒症中的表达情况，国内外学者已作了大量有益的一r 作。人们通常采用注射致死量大肠杆菌，注射内毒索脂多糖及盲肠结扎加穿刺( C L P ) 等方法建立脓毒症的动物模型，相比而言，C L P 法似乎能更好地反映I 临床病理过程”。在给予狒狒致死嚣的大肠杆菌攻击后，研究了T N F I L 一6 和I L 1 的产生发现在注射人肠杆菌后2 小时内I L l 升高，3小时即达峰值，而I L 一6 升高延迟，至8 小时才达剑高峰。使用T N F d 抗体能有效抑制I L 一6 和儿一l的水平，提示T N F n 是介导多种细胞因子合成和严重感染并发症的关键物质。H a d j i m i n a s 等”3 分别采用C L P 和腹腔l = | 毒素攻击建立小鼠的脓毒症模型，观察不同纰织下N F a m R N A 的表达情况。结果显示，两种模型中肝肺绍织T N F o m R N A 的表达在伤后早期均迅速增多，内毒素攻击小献腹腔巨噬细胞T N F c t m R N A 水平在05 小时急剧一l J I ，6 小时后恢复至伤前值。而C L P 小鼠腹腔巨噬细胞T N F m n R N A 水平呈持续性升高，伤后2 4 小时达峰值。另外，M e y e r 等“报道表明，小鼠内毒素血疵和C L P 后肠组织I L 6 m R N A 水平分别于伤后卜4 小时，8 小时达到高峰，且持续较长时间，但循环I L 一6 含量仅旱一过性升高，伤后8 小时即降至止常范同。这些观察i 止明，脓毒症时体内T N F n 及1 L 6 基因表达的上调可能参与了宿主失控的炎症反应过程，血浆T N F 一及I L 6 水平的升高则是基冈表达上调的结果。当然，上述研究中所表明的丁N F 一及I L 6 的变化是在G 菌所致的脓毒症模型中观察到的，那么，在G + 菌所致的脓毒症中。二者的变化又如何呢? 有人给狒狒注射了致死量的金黄色葡萄球菌，同样观察剑金黄色葡萄球菌攻击后可显著诱导T N F 及I L 6 的合成与释放。早在1 9 8 7 年W a a g e ”等观察到脑炎戏球 轩感染时T N F o 在病人体内明显增加，并且T N F 水平与病死率密切相关。同样脑炎双球菌脓毒性休克病人中I L 6 亦升高，I L 6 出现较T N F 一延迟。2 9浙江大学坝士学位论文等抑制T N F n 的基因表达。尽管人们在实验室研究中取得了令人鼓舞的成果，然而在临床实验中的结果却令人失望，甚至有报道说使用T N F 拮抗剂可增加脓毒症的病死率。有人认为这可能是因为应用剂量不当，治疗时间不止确，病情太重等的原因”。但这样的解释似乎并不令人满意。近年来，B o n e ”“针对细菌感染、创伤或休克时机体产生的可引起免疫功能降低和感染易感性增强的内源性抗炎反应，提出了代偿性抗炎症反应综合征( C A R S ) 的概念。机体炎症反应和抗炎反应作为对立的力量，常常是不平衡的。如果岍者保持平衡，则维持内环境稳定，不会引起器官功能损伤。当炎症反应占优势时，即表现为S I R S ，抗炎反应占优势时，则表现为C A R S 。无论是S I R S或是C A R S 均反映了机体炎疵反应失控，内环境失去稳定性，最终可导致M O D S 。此外，B o n e 等还认为，C A R S 是S I R S 发展中的一个时期。近驯的研究办表明，脓毒症具有_ ) ) ( 相性：第一阶段以释放促炎性细胞因子如T N F - mJ L I 和I L 一6 为特点。第二阶段为了对抗正在进行的炎症反应，机体释放抗炎介质如T G F1 3 、I L 一1 0 和P G E 2 。根据是促炎反应还是抗炎反应为土，发展为S I R S或C A R S 。由此可见，以往单纯以抗炎反府为土的免疫疗法治疗脓毒症可能存在策略上的错误，以此来解释为何以下调针对内毒素、T N F 一和I L 1 等细胞因子为目的的I 临床试验失败便令人满意了。不难想象，对脓毒症的免疫治疗应以免疫平衡为目的，既要避免S I R S 义要防止C A R S ，而在以T N F - a 为目的因子的免疫治疗措施中，更应该在正确判断机体免疫状况的前提条件F 决定是抑制T N F n 亦或是促进T N F 的表达。重组人活化蛋白质C ( A P C ) 是g t 前少数具有改善脓毒症效果的抗凝药物。2 0 0 1 年美国F D A 批准重组A P C 用丁重度脓毒症的治疗。国际多中心的随机临床试验表明，重组A P C 可使死亡的相对危险降低1 9 ，4 和绝对危险降低61 这住脓毒症研究史上被认为是突破性的进展“。用药后患者的f 【浆D 一：聚体和I L 一6 水平降低，提示凝血活性和促炎因子生成受抑。分层分析进一步显示，病情愈重，受益愈大：多器官功能障碍综合征患者病步匕率降低7 4 ，A P A C H E I I 评分为2 5 的患者病死率降低1 2 8 。值得注意的是，A P C 可影l 恂N FKB 的活性，而N FxB 是炎症反应重要的信号转导通路，可调控T N F a 、I L 一1 、I L 一6 等请多细胞因子的基因表达。给予重组A P C 治疗的患者血清I L 一6 水平显著降低。S I R