2DE流程及磷酸化染色

12DE 流程流程一向电泳一向电泳（1）：）：蛋白样品的准备蛋白样品的准备（从上午（从上午 11 点到下午点到下午 6 点；或者是第一天晚上到第二天上午）点；或者是第一天晚上到第二天上午）1.蛋白的裂解：蛋白样品从-20 ºC 取出，加入 300l 蛋白裂解液，进行蛋白裂解方法 1：4 ºC 冰箱过夜 方法 2：4 ºC，800rpm，4h 以上4 ºC ，13000 rpm，15min，上清转移至 1.5mL 离心管。 2.蛋白的定量：（如果样品数目少时，标准曲线和样品一块做）（1）取 5l 样品于 2mL 离心管中，加入 500l precipitant，迅速涡旋，室温静置 2-3min（2）加入 500l co-precipitant，迅速涡旋，室温静置 2-3min（可不静置）（3）4 ºC ，13000 rpm，5min，倒掉上清；（此期间配工作液）再离心一次，用移液器吸尽上清。（4）每管中加入 400l Milli-Q 和 100l copper solution，涡旋（5）每管中加入 1mL 的 working color reagent(工作液)，迅速涡旋工作液配方: color reagent A: color reagent B=100:1 (1100l: 11l)（6）室温静置 15-20min 左右，480nm 测定吸光度值，加完工作液后 40min 内要测定完成。(以 Milli-Q 做空白对照)蛋白标准曲线的测定蛋白标准曲线的测定：按照下表取 BSA 样品于 2mL 离心管中，如上面的方法进行蛋白的定量,以吸光度为横坐标,蛋白含量为纵坐标作图,用 EXCEL 表计算蛋白标准曲线公式.123456BSA (l)0510152025蛋白量(g)01020304050吸光度0.830.7290.6570.5910.510.408BSA 蛋白含量：2g/l22D蛋白标准曲线(20110302)y = -122.93x + 101.32 R2 = 0.995010203040506000.10.20.30.40.50.60.70.80.9 吸光度蛋白含量（g）将样品的吸光度值带入公式，求出 y 值。 y/5 即为每 l 样品中蛋白的含量。3. 一向电泳中蛋白样品的加量:传统双向电泳的蛋白上样量为 600g（，18cm 胶条）和 1200g（pH4-7，18cm 胶条） 。以 pH3-10 的胶条为例,加样量为600/ y/5一向电泳（一向电泳（2）：）：IEF-PAGE(头天下午头天下午 5-6 点上好一向，第二天晚上点上好一向，第二天晚上 7-8 点下一向，这样可以保证晚上二向电泳的点下一向，这样可以保证晚上二向电泳的顺利进行顺利进行)预约一向电泳仪，提前准备好 holder，提前 0.5h 从冰箱取出水化液2.准备上样液：样品1样品2蛋白裂解样品l水化液l358蛋白裂解样品1358蛋白裂解样品21%溴酚蓝（可不加）1lDTT1mgIPGbuffer1.83l胶条号切角3混匀样品，将样品4，13000 rpm，15min。（离心期间取出IPG胶条，室温放置10min）3.上样：（1）加样（从正极往负极加，注意无气泡），将样品均匀加入到holder内。（2）小心撕下保护膜，胶面朝下放入holder中，胶条正极要抵头，从正极到负极，轻轻放下胶条，避免生成气泡。(3)吸取适量覆盖油（1.5 ml）轻轻加在IPG胶条表面，以防止IEF-PAGE过程中液体的蒸发，盖上盖子。4.电泳：（1）打开电源，小心将holder放在IEF水平电泳仪上，正极对正极，负极对负极，压好。（2）待仪器自检完后，利用edit键设置参数，注意设定胶条的数目。设置参数：30V 12 hr，300V 1h，500V 1h，1000V 1 hr，3000V 1 hr，8000 V - 8000 0Vhr ， 400 V <2hr。(共26h)电泳开始后电流应小于5A, 如果大于此值，表明样品中盐离子太高。如果不能顺利升到8000V，证明样品有问题，也有可能电泳仪表面有冷凝水，接触不良电泳结束后，按3次STOP，之后关闭电源，取下holder，擦净电泳仪。4二向电泳（二向电泳（1）：二向前准备工作）：二向前准备工作1.配制12%的SDS-PAGE分离胶（2板,80mL）至少在二向前2-3h准备好30%Arc-Bis1.5M Tris-Hcl(Ph8.8)Milli-Q10%SDS10%APSTEMED32 mL20 mL26.4 mL800l800l50l2.配制平衡液在一向电泳结束前1h20min将平衡液从冰箱中取出，待平衡液融化后配平衡液1和2。IAA（碘乙酰胺）比较难容，且溶解过程中不能剧烈震荡。可放在摇床上轻摇溶解。平衡液平衡液1：0.1gDTT+10mL平衡液平衡液 平衡液平衡液2：0.4gIAA+10mL平衡液平衡液二向电泳（二向电泳（2）：胶条平衡）：胶条平衡1.IEF-PAGE结束后，小心取出胶条，用Milli-Q冲洗胶条表面（反复冲洗，在吸水纸上清蘸），去除覆盖油，放入含有1% DTT的平衡液1中，（胶面向上，即胶条上的字儿为反向）平衡15min；2.取出胶条反复冲洗，再转入含有4% IAA的平衡液中（胶面向上），平衡15min；（此期间将封顶液用微波炉加热准备好）3.胶条转入1×电极缓冲液润洗5min。（胶面向上）此时将凝胶上的水用滤纸吸干净二向电泳（二向电泳（3）：）：SDS-PAGE1.放胶条：将胶条两端多余的部分剪掉，然后转移至凝胶表面（胶面向外），用0.5%琼脂糖封顶液小心封胶，用卡片压胶使凝胶与胶条接触紧密，一定要避免产生气泡。2.电泳：加入新鲜配制的1×电极缓冲液，15mA/胶进行电泳，当溴酚蓝指示剂将出玻璃板底时，停止电泳，关闭电源。若以12mA/胶进行电泳，从头天晚上10点开始到第二天8点结束，一般10-11h左右3.染色和脱色（1）染色：卸胶，切角，用少量蒸馏水洗胶，再放入新鲜的SDS染色液中，染色45min。 （SDS染色液最好新鲜配制，最多使用2-3次，重复使用的，要过滤）（2）脱色：倒掉染色液，用脱色液脱色34遍，直到能观察到清晰的蛋白点。4.扫胶：注意两块胶要使用同样的分辨率，且黑白和彩色都要扫。55.扫胶后用保鲜膜将胶包好，贴上标签（名称、胶条号、切角、操作人、日期），放入4 ºC冰箱保存。2DE 流程(磷酸化染色)（1）蛋白提取时要加磷酸酶抑制剂（phosphatase inhibitor Roche company）1tablet to 10mL蛋白提取液（2）2DE流程与普通2DE一致，但洁净度要求高，所接触容器均需用Milli-Q洗涤，电泳槽要彻底洗干净，电极缓冲液必须用新的。（3）从染色开始避光,扫描用Typhoon扫描仪,比较费时过程：（从2DE结束后开始,大约用时一天）1.固定：2次（第一次30，第二次30min或固定过夜）2.水洗: 3次，每次10 min ，Milli-Q( 此时可准备染色液)3.染色：240mL染色液，2h(避光,直至扫描结束)4.脱色：4次，每次30 min5. 水洗：2次，每次5 min，Milli-Q6.扫描 磷酸化染色所用试剂1.固定液: 50%甲醇,10%冰醋酸2.染色液: 80mL新染液+160mLMilli-Q(或旧染液) 临用前配制,配好后避光放置。（根据胶的数量，按比例配制）染色液需回收,可重复利用三次。 Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain(避光保存，6000元/瓶)3.脱色液: 1M醋酸钠(pH4.0) 50mL 乙腈(acetonitrile) 200 mL 用Milli-Q定容至1L4. 1M醋酸钠(pH4.0)200mL需加5mL左右的浓盐酸调节pH6Typhoon 扫描仪的使用扫描仪的使用使用前向实验室管理老师索要电源线1.提前半小时开机。开机后要暂时先关闭电脑2.待预热结束后打开电脑，打开扫描软件3.放胶（注意胶在扫描仪上的位置从：从左到右为1-22，从下到上A-Z）4.扫描前调节：（1）选定扫描范围（例如4-15，E-F）（2）初步调节a. Pixel size:1000(预扫) ，正式扫描时再调整为100b. 将DIGE前的去掉c.点setup键，进入新页面，将234选项前的去掉，只留下1参数设置：在1选项中调节Emission Filter 为560LPGen.PurpPMT值暂时调节为500，再选择Laser Green 532, Sensitivity Normal, 最后点OK确定5.预扫：点击SCAN，根据Save as提示输入文件名 然后等待1min左右，直到返回主界面。找到预扫的文件，击右键，选择imagequant Appilication,进入新的界面，从其左侧的一竖行菜单中选择矩形工具，在胶上选择颜色最深点，划出矩形框，然后点击其左下角volume review 图标，查看该点的信息，即Max Vol的值，该值在5万-8万之间才能进行正式扫描。根据预扫的结果从setup 开始重新调节,逐步增大PMT的值, 直至Max Vol落到合适的范围即可结束预扫.76.正式扫描:调整Pixel size为100,点击SCAN,正式扫描(此过程大约需要10min左右,要耐心等待。)7.扫描结束后关掉软件，先关扫描仪，再关电脑。