高血压的基因治疗

高血压的基因治疗高血压的基因治疗摘摘 要要 用于高血压基因治疗的候选基因包括促进血管舒张的基因以及抑制血管收缩的基因。因此，高血压的基因治疗包括两种途径：一是插人引起血管舒张基因的顺义疗法；二是导人抑制血管收缩基因的反义疗法。本文着重讨论了引起血管舒张的激肽释放酶(KK)基因、心钠肽(ANP)基因以及抑制血管收缩的抗血管紧张素原(AGT)基因、抗血管紧张素受(ATlR)基因、抗血管紧张素转化酶(AcE)基因的作用机理和各自的优缺点。关键词关键词 高血压 ; 基因治疗：顺义; 反义近年来随着高血压病因研究的不断深入，对于高血压的治疗从药物种类、剂型，乃至针对病因的个体化治疗，都取得了很大的发展。在传统的药物治疗取得5明显疗效的情况下，基因治疗高血压的研究和应用前景是一个深受国内学者关注的问题。多年来高血压的治疗一直依赖于药物，但现有的降压药物均存在不同程度的副作用和并发症，严重的副作用迫使部分病人放弃治疗。由于高血压为终生性疾病，有效的降压治疗必须每天服用降压药，这也使部分病人难以坚持。而且据调查仅有2035的高血压病人药物治疗取得令人满意的效果。此外，治疗高血压的药物均为外来人工合成品，对于人体而言是一种非生理状态。从生理角度出发，人们更欢迎采用一种生物手段，在保持人体生理状态的同时，又能达到治疗的目的。因此，基因治疗高血压就是这样一种理想的手段。因为基因治疗具有高度的靶组织特性和生物活性，以及疗效的长久性(数日、数周、数月，甚至可达一年或更长时间仍可有效地控制血压)，而且副作用少，可以重复应用。毫无疑问，随着基因治疗研究所取得重大的突破，将为高血压的治疗提供有意义的治疗手段，基因治疗高血压的前景令人鼓舞。用于高血压基因治疗的候选基因包括促进血管舒张的基因以及抑制血管收缩的基因。因此，高血压的基因治疗包括两种途径：一是插人引起血管舒张基因的顺义疗法；二是导人抑制血管收缩基因的反义疗法(反义抑制)。顺义基因疗法顺义基因疗法高血压的顺义(正义)基因疗法，可采用质粒DNA注射或病毒载体携带的血管舒张基因，如激肽释放酶基因和心钠素基因，通过增强扩血管基因的表达来抗高血压。1-11-1激肽释放酶激肽释放酶(Kalliktein(Kalliktein，KK)KK)基因治疗高血压基因治疗高血压研究表明KK基因与血压之间存在遗传连锁关系，KK在血压的调节中起重要作用，其激肽释放酶一激肽系统(KKs)异常被认为是高血压的发病机理之一。wang等对KK基因治疗高血压作了探索，他们将构建的人类组织激肽释放酶质粒DNA，经静脉注入自发性高血压大鼠(sHR)，并应用逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)出印迹分析和针对人类组织激肽释放酶基因的酶联免疫吸附试验(EuSA)法证实，KK基因及其mRNA在SHR心、肺、肾表达明显增强，同时sHR血压持续下降达6周，最大幅度达46mmHg，23周降压效果最明显。上述降压效应可被皮下注射抑肽酶(Apmtinin)所逆转。之后，Katsutos“副等应用腺病毒携带人类组织激肽释放酶基因(AdcwVcHK)对高血压大鼠静脉注射，在注射后一天血压开始下降，降压效果持续超过24天，而对照组注射腺病毒携带细菌Lacz基因(AdCMVLacz)无上述变化。用RTPCR Southem印迹法及EUSA法分析鉴定，人类组织激肽释放酶mRNA在肾、心、主动脉和肝表达。在鼠的血清及尿中可以检测到与时间有关的具有免疫活性的KK，从形态学观察左心室重量下降，心肌细胞缩小，肾小球硬化和肾小管扩张被抑制。高血压大鼠肾血流量增加，尿量增加，GFR增加，电解质排除增多。实验表明，组织激肽释放酶可产生广泛的有益的生物学效应，KK基因可能是治疗盐敏感性高血压、心血管疾病的肾脏疾病的重要候选基因。1 12 2 心钠肽心钠肽(Atrial(Atrial NatriureticNatriuretic PeptidePeptide，ANP)ANP)基因治疗高血压基因治疗高血压ANP具有扩血管、利钠、利尿和降压作用，提示ANP基因可能在对高血压的治疗中发挥作用。Lin_91等用腺病毒携带人类组织ANP基因(AdRsVANP)，对Dahl盐敏感大鼠(Dss)静脉注射，在注射后3天血压开始下降，降压效应维持超过5周，最大降压幅度达328mmHg，对照组注射AdcMVLacz无上述改变。用RTPCR Southem印迹法及特异性ELISA法进行检测，具有免疫活性的人ANP在心、肺、肾中表达，出现肾血流量、GFR、钠排泄及尿量增加，尿中cGMP增加，提示血压下降可能由于NO刺激细胞内cGMP增加所致；形态学上的心肌细胞肥大、肾小球硬化、肾小管损伤及主动脉增厚出现逆转。反义基因疗法反义基因疗法目前研究和应用比较多的是反义基因疗法。反义基因疗法指应用反义核苷酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达。反义核苷酸目前可分为三类：(1)将反义寡聚脱氧核苷酸(As一0DN)连接到所需的表达载体(病毒、质粒)上，转染细胞后，转录出反义RNA(ASRNA)，与靶mRNA形成双链结构阻断翻译过程；(2)人工合成反义核苷酸(AsDNA、ASRNA)，通过与靶mRNA、DNA互补结合阻断转录翻译过程；(3)通过核酶直接降解靶mRNA。目前实验中多采用第一、二类反义基因疗法抗高血压。大量实验表明以不同载体将血管紧张素原反义基因(AGTAs)、AT，受体反义基因(AT，RAs)、血管紧张素转换酶反义基因(ACEAS)。传递至SHR体内，发现它们对SHR的确有明显持久的降压作用。在所有的研究中无任何资料表明反义基因疗法能影响wKY的血压，这表明反义基因疗法仅能抑制过度活跃的激素的功能，如SHR的RAS，但不影响正常激素系统的生理功能。而且反义基因疗法对实验动物的心率、体重、形态和行为等均无显著的影响。随着研究的深人，人们发现反义基因疗法还能逆转高血压引起的一系列病理改变，如心肌肥厚、血管增生等。2 21 1抗血管紧张素原抗血管紧张素原(Angiotensinogen(Angiotensinogen，AGT)AGT)基因治疗高血压基因治疗高血压在传统治疗中没有针对于AGT的药物，反义基因疗法首次以AGT为靶目标，并取得明显的降压效果。最早研究反义分子治疗高血压的Gyurko用合成的AsODN转移入SHR的脑室内，结果显示动物模型的高血压与脑中RAS过强表达有关18|。他设计的ASODN为抗AGT为反义寡聚核苷酸(磷酸二酯型)，对sHR脑室内单次注射剂量为50恤g的AsODN后，SHR血压明显下降。平均血压下降达35mmHg，大多数血压降至正常范围。在注射反义分子8小时后即出现降压效果，24小时后达峰值。之后的1998年，Makino等给SHR静脉注射抗AGT的ASODNs，SHR血压下降达30HlIIlHg，并维持5天，通过用RTPCR Southem印迹及特异性ELISA证实，sHR血浆中AGT水平暂时下降，同时sHR肝脏中AGT mRNA也下降，血浆AGT蛋白含量，血浆、血管和心肌组织中Ang减少，其中血浆Ang浓度能降至wKY的水平。而且能抑制血管和心肌胶原纤维的汇聚，降低心肌细胞直径和心室肥厚指数，表明AGTAs对高血压心肌肥厚、血管增生有逆转作用。 2 22 2抗血管紧张素受体抗血管紧张素受体1(AngiotensinReceptorl1(AngiotensinReceptorl，ATlR)ATlR)基因治疗高血压基因治疗高血压Phillips等构建抗AT。R的反义核苷酸(AT，RAS)，用抗AT，R mRNA的反义分子对SHR模型脑室内注射，产生的降压效果达7焉血压下降达30mmHg，同时AT，R数目在室旁核和第三脑室中的含量明显下降，脑中的Ang也明显减少。所有资料都证实ATlRAs在正常血压大鼠(wKY)体内确有表达，经RTPCR检测发现AT、RAS的确降低了AT1受体数目(约40)，并抑制其功能。经AT，RAS处理过的WKY，在给予外源性Ang，并不引起相应的致渴效应和压力反应。给wKY长期注射小剂量Ang，在不引起血压增高的条件下发生了心肌肥厚，而经AT，RAs处理过的wKY，给予同样的处理并不发生这种Ang依赖性的心肌肥厚。这表明ATlRAs对高血压有预防作用。此外，Marten等对幼龄(1周)sHR心腔内注射病毒携带的AT，RAS DNA后，证实转基因治疗可以防止高血压的发展，并可使血管舒缩反应正常化。 R-AS与AT，受体拮抗剂一样，它是在受体水平拮抗循环和局部组织中·Ang的生理功能。AT。RAs对SHR的降压幅度和Losantall相似，但作用时间更长，服药后LDsantan药效于24小时最大，24小时内作用消失。而ATlRAS一次给药后，作用时间长达数十天。而且AT，RAS并不引起血浆Ang的增高，这无疑是较Losantan的又一优势。Marten等进一步证实AT，RAS能阻止高血压左室肥厚和心肌纤维化的发生，同时也能降低sHR冠状动脉、肾动脉的管壁与管腔的比例，增加血流量，改善心肌和肾脏的代谢。研究表明高血压时，肾血管阻力增强的根本原因是血管平滑肌细胞(VSMC)中离子通道功能的改变，如钙离子电流密度增加，细胞内钙浓度增高，钾浓度降低，ATlRAs能逆转这种离子失衡。上述研究对象主要集中在高血压基因动物模型sHR。有资料表明，针对RAs的反义基因疗法对冷介导的高血压动物模Dawely也有明显的降压作用。Peng等采用脑室内注射AGT mRNA，AT。RmRNA的反义核苷酸，可使其血压明显降低达(41±10)mmHg，寒冷引起的自发饮水反应也明显降低；心肌内注射AT，RAsODN，降压达(36±8)mmHg。给药24小时后，放射自显影法显示大动脉、肾、肾上腺的AT，R的数目明显减少。该试验结果表明ARAS，AGTAS对冷介导高血压有明显的降压作用，而且进一步证实外周组织、中枢RAs对高血压的发生与发展均起重要作用。2 23 3抗血管紧张素转化酶抗血管紧张素转化酶(Angiotensin(Angiotensin I IConvertingEnzymeConvertingEnzyme，AcE)AcE)基因治疗基因治疗 高血压高血压 wang等给sHR静脉注射逆转录病毒AcE反义核苷酸(LNsVACEAs)，同样也产生了明显而持久的降压作用，降压幅度为1317mmHg，维持时问可达数周，而且能够阻断高血压引起的心脏、肾脏、血管内皮的病理生理改变。实验中尚发现正逆转录病毒的作用下，AcEAs被整合人亲代基因组中，并传递给子代，因而经AcEAs处理过SHR的子一代的血压较对照组SHR明显降低，而且其心肌肥厚也较对照组有改善。因此，以ACE为靶目标的反义基因疗法的意义是相当重要的，因为AcE和激肽系统、纤溶系统以及内皮功能的改善均有着密切关系。总之，尽管针对于RAS的反义基因疗法只是高血压基因治疗的一种途径，相比之下，AT，RAs较AGTAS和ACEAS更能彻底地抑制RAS的活性。另外还可以通过增强扩血管物质的表达，如增强心钠素、缓激肽、NO的表达来抗高血压，而且这些已在动物实验中取得成果。但是在这种血管舒张物质的“顺义疗法”和血管收缩物质的“反义疗法”之间，仍需要做进一步的研究和对比，真正在人体上应用之前仍有许多问题要解决。如研究所涉及的目的基因为数不多，如何延长体细胞基因治疗高血压的持续时间等，此外，还有许多理论、技术、伦理道德方面的问题均有待进一步解决。参考文献参考文献1 张西蘅医学分子生物学M北京：北京医科大学出版社，1999：9732 Philhps MIIs gene ther a_py for hypenension possibleJH)rpertension，1999，33：83 王琳芳，杨克恭