聚谷氨酸的检测方法

聚谷氨酸测试方法聚谷氨酸测试方法1.0 适用范围：本方法适用于聚谷氨酸半成品及成品的 HPLC 纯度分析(第 4 段、第 5 段中，蓝字为食品级及化妆品级 PGA 纯品粉末的样品制备方法;红字为 PGA 发酵液的样品制备方法) 2.0 仪器与设备： 2.1 Pump：SHIMADZU LC-10AT 2.2 Autosampler：PERKIN ELMER series 200 autosampler 2.3 Col umn ：TOSOH TSK Guard columnTOSOH TSK-GEL G6000PWXL TOSOH TSK-GEL G3000SW2.4 Detector：PERKIN ELMER 785A UV/VIS Detector 3.0 试剂的制备 3.1 0.05M Na2HPO4 (disodium hydrogenophosphate , MW. 141.96g/mol) 称取 Na2HPO4 7.1g ，加入去离水 800mL 溶解 ，最后以去离水定容至 1L 。 3.2 0.05M NaH2PO4H2O (Sodium dihydrogenophosphate monohydrate, MW.137.99g/mol) 称取 NaH2PO4H2O 6.9g，加入去离水 800mL 溶解，最后以去离水定容至 1L。 3.3 磷酸缓冲溶液，pH7.0 将 0.05M Na2HPO4与 0.05M NaH2PO4H2O 以约 10：7 的比例混合，微调至 pH7.0，以 0.45m 滤膜过滤。 4.0 PGA 样品前处理 4.1 称取 PGA 样品 0.04-0.05g 置入 50mL 烧杯中。 4.2 加入 40mL 的 0.05M Na2HPO4溶液。 4.3 利用磁石搅拌使样品完全溶解。 4.4 移入 50mL 定量瓶，以 0.05M Na2HPO4溶液定容至 50mL。 4.5 以 0.45m 滤膜过滤，装入样品瓶中。 4.6 将样品放入 HPLC 分析 。5.0 发酵液样品前处理 5.1 称取发酵液 2 g 置入 100mL 烧杯中，加入去离子水 80mL，利用磁石搅拌均匀。 5.2 以 1N H2SO4调整 pH4.0。 5.3 移入 100mL 定量瓶，以去离子水定容至 100mL。 5.4 取离心管秤取样品约 80g（重量包含离心管、盖、标签、样品） 。 5.5 利用高速离心机将菌体及杂质分离。离心条件为：转速 12,000rpm，时间 10min，温度控制在 4下。 5.6 离心后取上层液，以 0.45m 滤膜过滤后，装入样品瓶中。5.7 将样品放入 HPLC 分析。 6.0 标准品配制 6.1 称取 PGA 标准品 1g，加入 0.05M Na2HPO4溶解，最后定容至 100mL，作为 PGA 标准稀释溶液，浓度为 10000g/mL。 6.2 取 5 只 50mL 定量瓶，分别加入 PGA 标准稀释溶液 (10000g/mL) 1、2、3、4、5mL，以 0.05M Na2HPO4 定容至 50mL，其各点浓度分别为 200、400、600、800、1000g/mL。(分装储存于-20，使用时取出解冻，分析完后丢弃) 6.3 分别以 0.45m 滤膜过滤，装入样品瓶中，待上机分析。 7.0 HPLC 分析条件 Column ： TOSOH TSK Guard columnTOSOH TSK-GEL G6000PWXL TOSOH TSK-GEL G3000SWMobile phase ： 磷酸缓衝溶液，pH7.0 Flow ： 0.5mL/min Detector ： UV220 nm 7.1 标准品与样品分别以 Autosampler 取 20l 注入 HPLC 作定性定量分析。 7.2 另作空白组，操作步骤同检液。 7.3 以波峰面积为纵座标，-PGA-H 标准品的含量为横座标，绘制标准曲线，并建立线性回归方程式。 7.4 将样品的波峰面积数值，代入标准品线性回归方程式中，求得 -PGA 样品溶液的浓度，再带入计算公式，换算 -PGA 纯度。8.0 计算 -PGA 样品溶液的浓度以回归方程计算 y = ax + b x (yb) / a a：斜率 b：截距 y：样品的波峰面积 x：样品的浓度,g/mL -PGA 的纯度 (%) = × 100 =（C 樣 × D.F）/W × 100C 样：样品的浓度(g/mL) D.F：样品的稀释倍数 W ：称取样品重量, g 作为拌种剂使用一般稀释作为拌种剂使用一般稀释 5-10 倍拌种。倍拌种。