银杏叶提取物诱导大鼠主动脉平滑肌细胞中血红素氧合酶-1表达的实验研究

1银杏叶提取物诱导大鼠主动脉平滑肌细 胞中血红素氧合酶-1 表达的实验研究作者：汪红霞，杨晓瑜，魏宗德，黄维义【摘要】 目的探讨银杏叶提取物（EGb）诱导大鼠主动脉平滑肌细胞（SMC）中血红素氧合酶-1(HO-1)表达的量效关系，并初步探讨 EGb 诱导 HO-1 表达的分子机制。方法复苏并传代培养大鼠主动脉 SMC，分组实验，分别采用0，50，100，200，400 g/ml 5 个不同浓度的 EGb 以及 200 g/ml EGb 加放线菌素D（ActD）孵育 SMC 8 h，Western blot 法检测 HO-1 蛋白，以 HO-1 条带灰度值代表 HO-1 的表达量。结果不加 EGb 的对照组中 HO-1 蛋白仅有微量基础表达，加用 EGb 各组中 HO-1 蛋白的表达随 EGb 浓度的增加而增加（P0.05），在 EGb 浓度为 200 g/ml 时达到峰值，随后则有所下降。加用 ActD 能显著抑制 EGb 所诱导的 HO-1 蛋白表达（P0.05）。结论 EGb 能够诱导大鼠主动脉 SMC 中 HO-1 表达，且这种表达在一定范围内具有量效关系；EGb 诱导 HO-1 表达有赖于基因重新转录。 【关键词】 银杏叶提取物 大鼠 主动脉平滑肌细胞 血红素氧合酶-1Abstract：ObjectiveTo explore the dose-effect relationship and the molecular mechanism of the heme oxygenase-1(HO-1) expression induced by the extract of Gingko biloba(EGb) in rat aorta smooth muscle cells (SMC).MethodsThe SMC was revived,passage cultivated and divided into different groups.The cells in each group were incubated with 5 concentrations of EGb such as 0，50，100，200，400 g/ml and EGb 200 g/ml+ActD4 m respectively. The incubation lasted for 8 hours,then Western blot was applied to analyze HO-1 protein expression.ResultsThere was only basal microamount expression in the group without EGb. EGb significantly induced the expression of HO-1 in SMC and the expression increased with the increase of EGb concentration (P0.05),it reached the peak amplitude under the condition of EGb 200 2g/ml,then desceded.EGb-induced HO-1 expression was significantly inhibited by ActD.ConclusionEGb can induce HO-1 expression in rat aorta SMC and the expression has a dose-dependent feature under a limited EGb concentration range.EGb-induce HO-1 protein expression depends on HO-1 genetic retranscription.Key words：Extract of gingko biloba； Rat; Smooth muscle cell; Heme oxygenase- 1动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是危害人类健康的严重心血管疾病，近年来其发病率和死亡率更是不断上升，对其防治方法的研究一直倍受关注。已知氧化应激损伤是致 AS 的核心环节，抗氧化应激已成为防治 AS 的有效途径之一。血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）是血红素氧合酶的诱导型，在应对氧化应激损伤中发挥着不可或缺的作用，逐渐积累的证据显示，HO-1 系统在抗 AS 中起着重要作用1。银杏叶提取物（Extract of Gingko biloba,EGb）是传统中药银杏中的一种标准提取物，主要包含黄酮类和萜类内酯化合物，有抑制 AS 斑块形成和抗低密度脂蛋白体外氧化修饰等作用，是临床治疗 AS 的有效药物，但 EGb 能否诱导 HO-1 表达并籍以发挥抗 AS 作用尚不得而知。本文拟对 EGb 诱导体外培养的大鼠主动脉 SMC 中 HO-1 表达作用作初步探讨。1 材料与方法1.1 材料大鼠主动脉平滑肌细胞株（Smooth muscle cell,SMC）第 3 代由四川大学华西医院传染科侯洁博士赠送；细胞培养试剂包括 DMEM/F12、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜等购于美国 Gibco 公司；银杏叶提取物（金纳多注射液）购于德国Willmar Schwabe 药厂；放线菌素 D（ActD）购于 Sigma 生物试剂公司；免疫试剂：一抗（小鼠抗大鼠 HO-1 单克隆抗体）、二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG抗体）购于 Stressgen Biotech 公司；Westren Blot 检测试剂购于 Sigma 生物试剂公3司。1.2 方法复苏大鼠主动脉 SMC 株第 3 代并传代培养至第 6 代，再以每孔 4×105 个细胞转至 6 孔板中继续培养；当 SMC 生长密度达到 80%左右时使用含 1%胎牛血清的培养基预处理 24 h 使细胞生长同步化。分组实验，每组 5 个复孔：EGb 诱导实验：分为 A，B，C，D，E 组，分别加入 0，50，100，200，400 g/ml 5 种浓度的 EGb孵育细胞 8 h。ActD 阻断实验：分为对照组、EGb 组及 EGb+ActD 组，分别加用等浓度的空白液、EGb 200 g/ml 及 EGb 200 g/ml+ActD 4 m，孵育细胞 8 h。随后收集细胞，加入细胞裂解液 300 l，冰上充分振荡裂解 1 h，高速低温离心取上清液提取蛋白。BCA 法测蛋白含量后，样品蛋白和上样缓冲液按 31 的比例混匀后，沸水浴中煮沸 5 min 使蛋白变性，短暂离心去除沉淀；制备聚丙烯酰胺凝胶，用微量加样器将已经处理好的样品以每孔 30 g 上样，并用 -actin（分子量42KD）作为内参校正上样量，电压 200v，电流 50 mA，电脉 2 h；考马斯亮蓝染色观察蛋白条带；电转移 1 h 后用脱脂奶粉封闭 PVDF 膜；TBST 洗膜后加入抗体（一抗稀释度 15000，室温下 2 h；二抗稀释度 110 000，室温下 1 h）；ECL 法免疫荧光显像。用 Image-Pro Plus 图像分析软件对 HO-1 条带进行分析，以 HO-1 条灰度值代表 HO-1 的表达量。 1.3 统计学分析实验所得数据用±s 表示，采用 F+q 检验，应用 SPSS 13.0 软件进行统计分析。2 结果2.1 EGb 诱导实验各组的 HO-1 蛋白表达对照组中 HO-1 蛋白电泳条带影随EGb 浓度增加而加深，在 EGb 浓度为 200 g/ml 时条带显影最深，当 EGb 浓度增4至 400 g/ml 时，HO-1 蛋白条带显影反而转浅，详见图 1。灰度值分析显示：对照组中 HO-1 蛋白仅有微量基础表达，50，100，200 g/ml 组 HO-1 蛋白表达逐渐增加，在 EGb 200 g/ml HO-1 蛋白表达达到峰值，随后呈下降趋势，详见表 1。表 1 EGb 诱导实验组蛋白印迹图像分析结果(略)2.2 ActD 阻断实验各组的 HO-1 蛋白表达 3 组中 HO-1 蛋白条带显影程度各有不同，EGb 组条带明显加深，而 EGb+ActD 组条带明显变浅，详见图 2。灰度值分析：EGb 组诱导的 HO-1 表达量显著高于对照组，EGb+ActD 组 HO-1 蛋白表达受抑，明显低于 EGb 组，详见表 2。表 2 ActD 阻断实验组蛋白印迹图像分析结果(略)3 讨论HO-1 即热休克蛋白 32（HSP32），分子量为 32kD，是细胞内的一种重要的抗氧化酶。HO-1 连同其酶解产物胆红素、CO 一起组成了机体重要的保护系统，广泛参与抗氧化、抗炎、抗细胞增殖、调节血管张力，参与细胞内信号传递等重要作用2，3。用免疫组化染色和原位杂交的方法研究已证明，在人和实验动物 AS 斑块巨噬细胞、肥大细胞和内皮细胞内，HO-1 是高表达的，这种适应性的高表达被认为具有抗 AS 的积极意义4。研究显示，增加 HO-1 表达能有效抑制 AS 的发生，反之，若用药物阻断 HO-1 活性则可使 AS 病变程度显著加重，表明 HO-1 系统在防止 AS 中起着重要作用，故合理调控 HO-1 表达可望成为有效防治 AS 新途径。HO-1 本质上是一种应激酶，具有高度可诱导性，但因 HO-1 基因启动区内存在着许多特殊的调控位点，诱导 HO-1 表达的信号通路非常复杂。众多致氧化应激损伤的因素如 H2O2、重金属离子、内毒素、OX-LDL 等均是通过改变细胞内氧化-还原状态来诱导 HO-1 的表达。一些生物黄酮在近年被证明是无细胞毒性的 HO-15诱导剂，有着光明的临床应用前景。EGb 是传统中药银杏中的一种标准提取物，主要成分为黄酮类和萜类内酯化合物，近来揭示，EGb 是一个天然的 HO-1 增效药，EGb 的抗氧化作用可能更主要通过诱导 HO-1 这一强大的细胞内源性抗氧化酶的表达实现的。已经发现 EGb 可以诱导大鼠睾丸中 HO-1 表达；另有报道，EGb可以增强 HO-1 活性从而抑制脂质过氧化及阻止 AS 斑块的形成5，6。但是，有关对 EGb 诱导 VSMC 中 HO-1 的表达的研究却比较缺乏，为填补这方面研究的空白，我们采用体外培养的大鼠主动脉 SMC 作为研究对象，结果显示 EGb 确实具有诱导 VSMC 表达 HO-1 的潜能，并且这种诱导表达在一定范围内具有量效关系，即随 EGb 浓度增加 HO-1 蛋白表达也增加，且在 EGb 浓度达 200 g/ml 时，诱导 HO-1 蛋白表达达到峰值，随后略有下降，其下降可能与其诱导机制中某些转录因子达到饱和有关，也可能是 HO-1 蛋白过度表达后出现了某种形式的反馈抑制。本文结果还显示，EGb 诱导大鼠 SMC 中 HO-1 的表达可以被 RNA 转录酶抑制剂 ActD 阻断，表明其表达是依赖于 HO-1 基因的重新转录。之前也有研究表明，同样是生物黄酮的姜黄素（curcumine）诱导人肾脏近端小管细胞 HO-1 蛋白的表达也是依赖于基因的重新转录，且这一过程经由 P38MAPK 及 Nrf2/ARE7,8等介导的细胞内信号转导途径。EGb 诱导 HO-1 基因转录与表达的具体细胞内信号转导途径是否与之相似有待进一步研究。已知动脉 SMC 是 AS 是病理过程的重要参与者。在致病因素的作用下，SMC经内弹力膜迁入内膜，并发生增生、表型转化、分泌细胞因子和合成细胞外基质，同时，经表面受体介导吞噬脂质，导致脂纹和纤维斑块的产生。研究发现，SMC内 HO-1 高表达能对细胞本身的增殖迁移等产生抑制作用，有助于拮抗6AS9，10。因此，我们的实验结果将为进一步探讨 EGb 防治 AS 的作用与机制