人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性

1人干细胞生长因子 cDNA 克隆、表达和纯 化及其造血种属特异性作者：原野，张云生，李秀森，郭子宽，刘晓丹，侯春梅，唐佩弦，毛宁【摘要】 人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式，包括全长分子 hSCGF 以及在 Ca2+依赖糖识别结构域（calcium-dependent carbohydrate recognition domain，CRD）内缺失 78 氨基酸的截短型分子 hSCGF。hSCGF 的造血刺激活性具有严格的种属特异性。本研究目的在于探讨 hSCGF 能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。为克服 hSCGF 的 cDNA GC 含量较高的困难，本研究以两步 PCR 的方法从人胎肝 cDNA 文库（Clontech）中成功克隆 hSCGF cDNA，进而将 hSCGF 成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体 pGEX4T-2 中，融合表达。研究结果表明，通过低温诱导（28），重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中，利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性分析表明，不同于截短型分子 hSCGF，全长分子 hSCGF 能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖。结论： hSCGF CRD 不直接结合受体，可能具有其他生物学功能。 【关键词】 cDNA 克隆Cloning，Expression and Purification of Human Stem Cell Growth Factor cDNA and Its Species-specificity in HematopoiesisAbstract Stem cell growth factor (SCGF) is an early-acting hematopoitic cytokine that has two isoforms including hSCGF with full length molecules and hSCGF，78 amino acids of which lost in the conserved calcium-dependent carbohydrate- recognition domain (CRD).It has been demonstrated that hSCGF is strictly species- specific in regulating he-matopoiesis.This study was aimed to explore whether human 2SCGF can exert synergistic stimulatory effect on heterogenous murine CFU-GM progenitor.Firstly，hSCGF cDNA was amplified from human fetal liver cDNA library by using two-step PCR.The hSCGF mature peptide coding sequence was subsequently placed at downstream of glutathione S-transferase (GST) sequence in GST gene fusion expression vector. The results indicated that there existed an additional 60 kD protein compared with mock BL21 when the cells hosting recombinant plasmid were induced with IPTG at 37.SDS-PAGE analysis demonstrated that the GST-hSCGF fusion protein mainly existed in insoluble form.When induced at low temperature (28)，the recombinant protein was mostly soluble.The GST-fusion recombinant protein was subsequently purified by using affinity chromatography.The clonogenic assay revealed that，unlike hSCGF，hSCGF had the granulocyte/ macrophage promoting activity (GPA) for murine bone marrow GM progenitor. It is concluded that，in contrast to human SCGF，the intact molecular hSCGF may have no species specificity，implying that CRD domain in human SCGF does not directly bind to corresponding SCGF receptor，but may have certain biological function.Key words human stem cell growth factor; CRD region; cDNA clone; fusion expression; hematopoietic species specificity细胞因子在造血过程中起到十分重要的调控作用1，2。Mio 等31998 年分离得到人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）全长 cDNA。该因子由 323 氨基酸组成，C 端含有 1 个保守的 Ca2+ 依赖糖识别结构域 （ calcium dependent carbohydrate recognition domain，CRD），因此属于 C 型凝集素（C-type lectin）超家族成员。hSCGF 的另一命名为 LSLCL，其基因已被定位于人染色体 19q13.3，由 4 个外显子和 3 个内含子组成4。已知人干细胞生长因子具有两种形式，全长分子 hSCGF 和在 CRD 结构域内缺失 78 氨基酸的截短型分子hSCGF5。研究表明，截短分子 hSCGF 除具有协同刺激造血活性之外，还能协同 VEGF 诱导 AC133 阳性细胞向内皮细胞分化5，6。hSCGF 的造血刺激活性具有严格的种属特异性，而全长分子 hSCGF 的同源性分析表明，人源 hSCGF与鼠源的 mSCGF 在氨基酸水平上具有 85.1%同源性，91%的氨基酸相似。为进一步探讨 hSCGF 的这种种属特异性是否与 CRD 结构域内部分缺失有关，本研究检测全长分子 hSCGF 能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。初步研究结果表明，3hSCGF 可以作用于小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞。材料和方法材料LA Taq DNA 聚合酶（with GC buffer）购自大连宝生物工程公司。T 载体pGEM-T easy 为 Promega 公司产品。DNA 连接酶，CIP（小牛肠碱性磷酸酶）以及各种限制性内切酶分别购自 LTI、Promega 及大连宝生物工程公司。原核融合表达载体质粒 pGEX-4T2 及宿主菌 BL21（DE3）均为本院陆承荣博士惠赠。亲和层析柱 GSTrap FF 购自 Amersham Pharmarcia 公司。hSCGF cDNA 克隆及鉴定引物上游： 5 CGCGAATTCGCCACCATGGAGGCAGCCTGGCTTTT 3；下游： 5 CGCGGATCC CTATTAGAAGGGGAACTCGCAGACGTAGTA 3。 PCR 反应：30 l 体系含 PCR 模板 3 l（1 g），2×GC buffer I (TaKaRa)15 l，dNTP (2.5 mmol/l each) 3 l，上，下游引 物各 1.5 l，LA Taq DNA 聚合酶 1.5 U，dd H2O 补足至 30 l。模板 95变性 2 分钟，开始 PCR 循环：95 20 秒，72 2 分钟，共 30个 循环，然后 72 保温 5 分钟。PCR 产物克隆与鉴定PCR 产物回收后，连接于 pGEM-T easy 转化于受体菌，单酶切鉴定重组质粒，由大连宝生物工程有限公司测序。hSCGF 成熟肽编码序列的扩增及融合表达载体质粒的构建4引物上游：5 GGATCCGGTCACGGTGCTCGTGGTGCTGAACGTGAGTGGGAGGGA 3 其中斜体下划线部分为 BamH I 识别位点。从后面的 GGT 开始为去掉了信号肽的hSCGF 成熟肽编码序列。下游： 5 GGATCCCTATTAGAAGGGGAACTCGCAGACGTAGTA 3 其中斜体下划线部分为 BamH I 识别位点，后面黑体为两个串联的终止密码子，相应于有义链TAATGA 。PCR 反应参数同前。回收 PCR 产物，与 T 载体连接，构建中间质粒pTsMT。测序后以 BamH I 切出 0.9 kb 左右大小的成熟肽编码序列 DNA 片段，亚克隆于融合表达载体 pGEX-4T2（Pharmacia）相应位点，构建融合表达质粒，命名为 pGSC 。重组表达 重组质粒 pGSC 转化 BL21（DE3）感受态细菌。挑单菌落 37震荡培养。培养物分别以 1/100 稀释接种于液体 LB（Amp+），37震荡培养至 OD600约 0.8。分别加诱导物 IPTG 至 0.1、0.5、1.0、1.5 和 2.0 mmol/L 。继续于 37，235 rpm 震荡培养 2 小时，SDS-PAGE 分析诱导表达结果。重组蛋白存在形式的分析取 37诱导表达产物超声破碎菌体离心收集上清，将沉淀重悬于 PBS。分别取上清及沉淀以 SDS-PAGE 分析重组蛋白存在形式。低温诱导表达及诱导表达重组蛋白存在形式的分析具体方法同前，将诱导温度改为 28。5重组蛋白纯化4离心收集 200 ml 28诱导培养物，重悬于 10 ml PBS（pH 7.3，含 PMSF）中。超声破碎后离心，收集上清存于 4备用。层析柱 GSTrap FF 以 PBS（pH 7.3）充分平衡，将存于 4的菌体破碎、离心上清以 0.5 ml/min 的速度上样，之后以PBS（pH 7.3）0.5 ml/min 的速度洗柱至基线。以浓度为 15 mmol/L 的还原型谷胱甘肽（GSH，溶于 50 mmol/L Tris.HCl，pH 8.0）洗脱重组蛋白。SDS-PAGE 分析纯化结果。融合蛋白协同刺激造血活性的初步分析以 Ficoll（1.083 mg/ml，Sigma）常规法分离 10 周龄 BALB/c 小鼠骨髓单个核细胞，进行半固体集落培养。实验分为 rmGM-CSF （5 ng/ml）组、rhSCGF 组和混合组。各组设 3 个重复，置于 37、5% CO2、饱和湿度条件下培养 7 天，然后计数，大于 50 个细胞计为 1 个集落。 结 果hSCGF 全长 cDNA 的扩增根据所设计的引物，PCR 产物应为包含 hSCGF 完全开放读码框架（ORF）的980 bp 片段，电泳检测结果显示 PCR 产物与预期结果相符。回收的 PCR 产物连接于 pGEM-T easy，测序结果与已发表序列相同。结果见图 1。37融合表达的 SDS-PAGE 检测hSCGF 成熟肽蛋白预测分子量为 33.8 kD，加上 GST