人参不同部位超氧化物歧化酶活力比较
1人参不同部位超氧化物歧化酶活力比较作者：李红艳，赵雨，杨士慧，张鑫，牛放，赵大庆【摘要】 目的比较人参不同部位-芦头、主根及须根 SOD 活力，为探讨 SOD 在人参药材中的分布及人参各部位的临床应用提供依据。方法样品采用中性缓冲液 4 浸提 24 h，采用改良的邻苯三酚自氧化法测定 SOD 活力，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。结果人参芦头 SOD 活力为 6.518 U/mg，主根 SOD 活力为 5.232 U/mg，须根 SOD 活力为 2.51 U/mg。结论人参 SOD 活力以芦头最高、主根次之，须根最低。 【关键词】 人参; 芦头; 主根; 须根; 超氧化物歧化酶Abstract：ObjectiveTo compare the superoxide dismutase (SOD) activity of rhizome, taproot and fibrous root of Panax ginseng and to provide the basis of the SOD distribution, the quality evaluation in the different parts of Ginseng and clinical application. MethodsThe samples were extracted by neutral pH buffer at 4 for 24 hs. Coomassie brilliant blue method was used to determine the protein concentration, and improved pyrogallol auto-oxidation method was adopted to determine the SOD activity. ResultsThe SOD activitity of rhizome, taproo and fibrous root was 6.518 U/mg, 5.232 U/mg and 2.51 U/mg, respectively. ConclusionThe SOD activity of different ginseng parts is different. The SOD activity in rhizome is the highest, taproot is followed, and fibrous root is the lowest.Key words： Ginseng; Rhizome; Taproot; Fibrous root; SODSOD(Superoxide Dismutase, EC.1.15.1.1.，超氧化物歧化酶)是一种能清除生物体内产生的超氧阴离子自由基(O2-·)的金属蛋白酶类，其广泛存在于一切生物体内，能清除超氧阴离子使其生成过氧化氢，然后过氧化氢又被其他酶分解为水和氧气，从而减轻或消除超氧阴离子自由基对机体的损害1。该酶具有潜在药用价值，具有抗衰老、抗炎、抗辐射、祛斑、抗皱等多种药理作用1，2，并且该酶还具2有较高的催化活性和化学稳定性，因此可以被作为药剂学及临床研究的参考因素3。人参为五加科植物人参 Panax ginseng C. A. Meyer.的干燥根。研究表明，人参具有抗衰老、抗氧化、增强机体免疫力等多种药理活性4，5。迄今已知人参根中含有人参皂苷、多糖、蛋白质等多种有效成分，但目前的研究大多针对人参皂苷，对于人参蛋白尤其是 SOD 的研究相对较少69。本实验通过比较不同产地人参芦头、主根和须根 SOD 活力，为科学评价人参不同部位质量提供科学依据。1 材料与仪器人参分别购自吉林省靖宇县、长白县、抚松县、临江市和安国县等 5 个地区，经长春中医药大学研发中心姜大成教授鉴定，均为五加科植物人参 Panax ginseng C. A. Meyer.，生长年限均为 5 年。高速离心机 Minispin，德国 Eppendorf 公司;CP225D 型电子天平(十万分之一), 北京赛多利斯仪器系统有限公司;LL3000 型冷冻干燥机，德国 Heto 公司;UV mini-1240 型紫外可见分光光度计，日本 Shimadzu 公司;Multiskan MK3 型酶标仪，美国 Thermo 公司。Bradford 蛋白质定量试剂盒，北京 Tiangen 公司;Tris(三羟甲基氨基乙烷)，美国 Sigma 公司;其他试剂均为国产分析纯。2 方法与结果2.1 样品的制备取 5 年生不同产地人参各若干根，切取芦头、主根及须根，分别磨粉。精密称取各参粉末 2 g，加入 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液 10 ml ，4浸提 24 h，10 000 r/min 离心 10 min，上清液用 0.45 m 滤膜过滤，收集滤液，3得 5 批不同来源的样品共 15 个。各样品留取 0.5 ml 待测定 SOD 活力，其余液体冷冻干燥，待测蛋白浓度。2.2 蛋白含量测定2.2.1 绘制标准曲线采用 Bradford 蛋白试剂盒法，将 0，10，20，30，40，50，60 l 牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1 mg/ml)分别加入到 EP 管中,加入 PBS 缓冲液补足到 150 l，混匀。从各管中依次取出 15 l，加入 285 l 考马斯亮蓝染色液，混匀，室温放置 510 min。转置 96 孔板中，于酶标仪 595 nm 处测定光密度值。以不含BSA 的缓冲液的光密度值作为空白对照，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程 Y=0.121 2X + 0.008 2，相关系数 R2=0.998 8。2.2.2 测定蛋白含量将冻干后的样品分别用 PBS 缓冲液配制成一定浓度，各取 15 l，加入 285 l 考马斯亮蓝染色液，于酶标仪 595 nm 处测定光密度值，每个样品设 3 个复孔，根据标准曲线，计算蛋白含量。结果见表 1。 2.3 SOD 活力测定上述样品分别采用改良的邻苯三酚自氧化法10进行酶活力测定。以 1 ml 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时所需的酶量定义为一个活力单位。在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据 SOD 抑制邻苯三酚自氧化能力测定 SOD 活力，以比活力 U/mg 蛋白表示，每个样品测 3 次取平均值。结果见表 1。根据表 1 数据，分别统计不同来源的 5 批样品芦头、主根及须根 SOD 活力。结果见图 1。表 1 人参不同部位 SOD 活力2.4 离散度考察利用 Excel 统计学软件，分别统计 5 批样品芦头、主根及须根SOD 活力的标准差与平均数，计算三者的离散系数(C.V)。结果见表 2。表 2 样品4离散度考察3 讨论本实验采用中性缓冲液抽提法从人参中提取人参蛋白，方法简便易行。结果显示，5 批样品人参蛋白收率均比较高，平均蛋白收率为 1.194%。 SOD 活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，在化学方法中，又以改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用该法测得人参芦头、主根和须根 SOD 活力相差悬殊，这说明人参不同部位存在一定的质量差别。离散系数的大小反应资料中各观测值的变异程度。本实验采用样本标准差与平均值的比值即标准差系数(C.V)考察人参各部位 SOD 活力的离散度。表 2 结果显示，芦头的离散系数较大，主根和须根的离散系数较小。这说明，人参 SOD 活力因产地不同而差别很大，尤其以芦头 SOD 活力受产地影响最大。据历代一些本草医籍记载，芦头具有涌吐作用，因此人参入药前要将芦头除掉。虽然已有一些报道认为芦头无涌吐作用，但仍有一些药厂及医院袭用旧法，将芦头去掉。本实验结果表明，芦头具有较高的 SOD 活力，这从侧面反映了芦头的药用价值。已有研究表明人参不同部位皂苷及无机元素含量有着明显区别11，12。本实验通过比较人参芦头、主根和须根 SOD 活力，结果亦显示了不同部位的含量差别。这提示我们人参不同部位可能具有不同的药用价值，同时说明 SOD 可作为人参质量评价的内在指标之一。5【参考文献】1 马振华，杨红强，杨 琼.超氧化物歧化酶(SOD)的功能及应用J.新学术，2008，4:316.2 时沁峰，曹威荣.超氧化物歧化酶(SOD)的研究概况J.畜禽业，2009，4:66.3 Anne D., Achim Z., Ralph P., et al. Heinemann, and Ivana Ivanovic- Burmazovic Water Exchange on Seven-Coordinate Mn(II) Complexes with Macrocyclic Pentadentate Ligands: Insight in the Mechanism of Mn(II) SOD MimeticsJ. Inorganic Chemistry， 2007，46: 7.4 刘 欣，杨 凌，崔 昱.人参皂甙的活性综述J.中国微生态学杂志，2005，17(1):76.5 Ng T. B., Wang H. Panaxagin, a new protein from Chinese ginseng possesses anti- fungal, anti-viral, translation-inhibiting and ribonuclease activitiesJ. Life Sciences 2001 ，68: 739.6 Kim S., Kweon S. M., Kim E. A., etc. Characterization of Rnase-like major storage protein from the ginseng root by proteomic approachJ. Journal of Plant Physiology，2004，161: 837.7 Yoon J. Y., Ha B. H., Woo J. S., et al. Purification and characterization of a 28- kDa major rotein from ginseng rootJ. Comparative Biochemistry and Physiology B, 2002，132:551.8 Wang H. X., Ng T. B. A ribonuclease from Chinese ginseng flowersJ. Protein Expression and Purification，2004，33:195.9 侯冬岩.人参超氧化物歧化酶的研究J.人参研究，1992，4:31.10 GB/T5009·171-2003.保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定S.413.11 王世民.人参不同部位的皂甙组成及含量J.国外医药·植物药分册，1981，5: 43.12 吴冬梅,屈海云,卢 菲,等.端视电感耦合等离子体原子发射光谱法测定人6参不同部位中的微量元素J.分析科学学报，2007，23(5):563.
