最新植物生理指标测定方法

1实验一实验一 植物叶绿素含量的测定（分光光度法）植物叶绿素含量的测定（分光光度法）(张宪政，张宪政，1992) 一、原理一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光 度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即 ACL 式中： 比例常数。当溶液浓度以百 分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， 为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长 下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数 种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。 这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、b 和类胡萝卜素的含 量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度 A，并根据叶绿素 a、b 及类胡萝卜素在 该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰， 所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素 a 和 b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素 a 和叶绿素 b 的比值反映植物对光能 利用效率的大小，比值高则大，则反之。 二、材料、仪器设备及试剂二、材料、仪器设备及试剂 试剂：1）95%乙醇（或 80%丙酮） 三、实验步骤三、实验步骤称取剪碎的新鲜样品 0.20.3g，加乙醇 10ml，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提 取液倒入光径 1cm 的比色杯内，以 95%乙醇为空白，在波长 663nm 和 645nm 下测定吸光度。四、实验结果按计算 丙酮法（丙酮法（Arnon 法）法） 【可以用于丙酮乙醇混合法和 80%丙酮提取法的计算】 叶绿素 a 的含量（mg/g） =（12.71OD663 2.59OD645）V/1000*W 叶绿素 b 的含量（mg/g） =(22.88OD645 4.67OD663) V/1000*W叶绿素 a、b 的总含量（mg/g） =(8.04OD663 +20.29OD645) V/1000*W按按 Inskeep 公式公式 叶绿素 a 的含量（mg/g） =（12.63OD663 2.52OD645）V/1000*W 叶绿素 b 的含量（mg/g） =(20.47OD645 4.73OD663) V/1000*W 叶绿素 a、b 的总含量（mg/g） =(7.90OD663 + 17.95OD645) V/1000*W 注：注：1、叶绿素 a 和叶绿素 b 的比值反映植物对光能利用 率【1】 比如阳生植物叶绿素 a 和叶绿素 b 的比值较大 【2】阴生植物叶绿素 a 和叶绿素 b 的比值较小2、丙酮-熔点:-94 ；沸点:56.48；是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味 易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂. 下一步实验方法比较【1】95%乙醇直接提取（）【2】95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985）【3】无水酒精和 80%丙酮等体积混合提取2实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（(张宪政，张宪政，1992)）一、一、原理原理 植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时， 细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，组织受伤害越严重，电解质含量增 加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。在电解质外渗透 的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增 加，氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，对紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同 样可反映出质膜受伤害的程度。用电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性。 二、方法步骤二、方法步骤 1、取样及处理、取样及处理采用电导法(张宪政，1992)：将选取的幼嫩叶片和成熟叶片剪下，包在密封袋内置于冰盒 中带回实验室。将新鲜的叶样先用自来水轻轻冲洗叶片，除去表面沾污物，再用去离子水冲 洗 12 次，用滤纸轻轻吸干叶片表面水分，称 0.20.3 g 并剪成切段，放入 50 mL 带塞试 管中，加入 20 mL 去离子 H2O，浸没样品 45 h，各处理浸泡时间和测定温度一致，在室温 下进行，用 DDs11 型电导仪测其电导率，然后沸水浴 15 min，冷却至室温再测一次总电导 率值。以相对电导率表示细胞质膜透性大小。2、计算：、计算：植物组织浸泡的电导率，特称外渗电导率，此测定方法称外渗电导率法。（1）外渗电导率）外渗电导率K（us/ /cm*g) =SQ=测定电导率测定电导率/ /称取质量称取质量或或 K（us/ /cm*g*ml）=SQ=测定电导率测定电导率/ /称取质量称取质量*量取体积量取体积 （2）相对电解质渗出率）相对电解质渗出率.电解质渗出率（电解质渗出率（%）= L1（浸泡液电导率）（浸泡液电导率）/ / L2（煮沸后电导率）（煮沸后电导率）××100 电解质渗出率电解质渗出率(%)= L1(浸泡液电导率浸泡液电导率)- -本底电导率本底电导率/ L2（煮沸后电导率）（煮沸后电导率）- -本底电导率本底电导率××100式中：式中：L1：组织杀死前外渗液的电导值；：组织杀死前外渗液的电导值；L2 组织杀死后外渗液的电导值。组织杀死后外渗液的电导值。 注：注：1、事先测定水的电导率、事先测定水的电导率2、用吸水纸吸干探头的水分、用吸水纸吸干探头的水分实验三实验三 植物体内游离脯氨酸含量的测定植物体内游离脯氨酸含量的测定一、目的一、目的在逆境条件下（旱、热、冷、冻） ，植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸 含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸 含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组 织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯 氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺3基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm 波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。三、材料、仪器及试剂三、材料、仪器及试剂1. .试剂及配制：试剂及配制： （1 1）2.52.5酸性茚三酮溶液配制酸性茚三酮溶液配制：将 1.25g 茚三酮溶于 30ml 冰醋酸和 20ml 6mol·L1 磷酸中（原液稀释原液稀释 2.32.3 倍倍） ，搅拌加热（70）溶解，贮于 4冰箱中，2-3 日有效。 （2 2）3 3磺基水杨酸配配制磺基水杨酸配配制：3.496g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至 100ml。 （3）10g·ml-1 脯氨酸标准母液配制：精确称取 20mg 脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入 200ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为 100g·ml1 脯氨酸母 液） ，再吸取该溶液 10ml， 加蒸馏水稀释定容至 100ml，即为 10g·ml-1 脯氨酸标准液。四、实验步骤四、实验步骤1 1、脯氨酸标准曲线的制作、脯氨酸标准曲线的制作 1.11.1 取 6 支试管，编号，按下表配制每管含量为 012g 的脯氨酸标准液。加入表中 试剂后，置于沸水浴中加热 30min。取出冷却。以去离子水溶液为空白对照，在 520mm 波长 处测定吸光度（A）值。1.31.3 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 以 15 号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2.2.样品的测定样品的测定 2.12.1 脯氨酸的提取脯氨酸的提取 称取 0.20.3g 叶片于 20ml 试管 + 10ml 3磺基水杨酸溶液沸水浴 10min（提取过 程中要经常摇动）冷却过滤于干净的试管中脯氨酸提取液。 2.22.2 测定测定管 号试 剂012345 10g·ml-1 脯氨酸标准液（ml） 蒸馏水（ml） 冰醋酸（ml） 3%磺基水杨酸 2.5酸性茚三酮（ml）0 2 2 2 40.2 1.8 2 2 40.4 1.6 2 2 40.6 1.4 2 2 40.8 1.2 2 2 41.0 1.0 2 2 4 每管脯氨酸含量（g）02468104吸取酶提取液 2ml2ml + + 2ml2ml H2O + + 2ml2ml 冰醋酸 + + 4ml4ml 2.5酸性茚三酮沸水浴 30min溶液呈红色冷却取上层液于比色杯 520mm 处测定吸光度（A）值。五、计算结果五、计算结果 从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量： X×X×提取液总量（提取液总量（mlml） 脯氨酸含量（脯氨酸含量（g·g1Fw） 样品鲜重（样品鲜重（g g）×× 测定时提取液用量（测定时提取液用量（mlml）公式中：公式中：X X 从标准曲线中查得的脯氨酸含量（从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g）实验四实验四 植物体内丙二醛含量的测定植物体内丙二醛含量的测定一、原理一、原理 丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过 氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量， 通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕 色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑 2、4二酮） ，三甲川最大的吸收波长在 532nm。但是测 定植物组织中 MDA 时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色 反应产物的最大吸收波长在 450nm 处，在 532nm 处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等 逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定 要排除可溶性糖的干扰。此外在 532nm 波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。 低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在 532、450nm 处的吸 光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组 织中铁离子的含量为 100300g·g1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入 Fe3 的终浓度为 0.5nmol· L1。在 532nm、600nm 和 450nm 波长处测定吸光度值，即可计算出 丙二醛含量。二、实验步骤二、实验步骤（1 1）提取）提取采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，20022002） 。称取0.20.3 g样品，加10%三氯乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml 三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm，离心10min。（2 2）显色）显色取上清液5 5 mLmL，加0.6% TBA 5 5 mLmL，混合后在100水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532 nm和600 nm处的吸光度值，方法一：方法一： MDAMDA质量摩尔浓度质量摩尔浓度(nmol/g)=(nmol/g)=( A532-A600)×VZ×V1/(0.155×W×V2)式中：VZ: 反应液总量(4 mL)； V1: 提取液体