2021鲑鱼甲病毒病检疫技术
鲑鱼甲病毒病检疫技术规范鲑鱼甲病毒病检疫技术规范1 范围本标准规定了鲑鱼甲病毒组织病理、病毒分离、逆转录聚合酶链反应、实时荧光逆转录聚合酶链反应、间接免疫荧光的检测方法。本标准适用于鲑鱼甲病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088出入境动物检疫采样3 缩略语下列缩略语延用于本文件。CHSE-214 ：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（Chinook salmon embryo-214） CPE ：细胞病变（Cytopathic effect）Ct ：达到阈值的循环数（Cycle threshold）dATP ：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（Deoxyadenosine triphosphate） dCTP ：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（Deoxycytidine triphosphate） DEPC ：焦碳酸乙二酯（Diethypyrocarbonate）dGTP ：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（Deoxyguanosine triphosphate） dNTPs ：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleotide triphosphates）dTTP ：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（Deoxythymidine triphosphate） EB ：溴化乙锭（Ethidium bromide）EDTA ：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminete traacetic acid） FITC ：异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate）HEPES ：4- 羟乙基呱嗪乙硫磺酸（4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhanesulfonic acid） IFAT ：间接免疫荧光（Indirect fluorescent antibody test）IPNV ：传染性胰腺坏死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus） RNA ：核糖核酸（Ribonucleic acid）RNase ：酶（Ribonuclease，RNA）RT-PCR ：逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction） SAV ：鲑鱼甲病毒（Salmonid alphavirus）4 疾病概述鲑鱼甲病毒病主要感染鲑科鱼类，该病病原鲑鱼甲病毒（SAV），属于披膜病毒科（Togaviridae）11甲病毒属（Alphavirus），其基因组为线性单股正链 RNA。参见附录 A。5 试剂和材料5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格，用 DEPC 处理以除掉 RNA 酶。5.2 SAV 病毒参考株，抗 SAV 抗体，由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。5.3 10% 甲醛。5.4 乙醇：70%、80%、95% 及无水乙醇。5.5 二甲苯。5.6 石蜡。5.7 苏木精染液。5.8 0.5% 伊红乙醇溶液。5.9 中性树脂。5.10 孵育液（见附录 B 中 B.1）。5.11 细胞培养液（见附录 B 中 B.2）。5.12 CHSE-214 细胞系：用细胞培养液 20 培养。5.13 逆转录酶：20 U/L，-20 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.14 RNase 抑制剂：20 U/L，-20 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.15 Trizol 试剂：RNA 抽提试剂，4 保存。5.16 Taq 酶：5 U/L，-20 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.17 dNTPs: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。5.18 RT-PCR 引物的序列如下：E2F: 5-CCG-TTG-CGG-CCA-CAC-TGG-ATG-3 E2R: 5-CCT-CAT-AGG-TGA-TCG-ACG-GCA-G-3扩增糖蛋白 E2 基因 516 bp 的片段（参见附录 C）。引物浓度为 40 moL/L。5.19 实时荧光 RT-PCR 的引物和探针的序列如下： QnsP1F: 5-CCG-GCC-CTG-AAC-CAG-TT-3 QnsP1R: 5-GTA-GCC-AAG-TGG-GAG-AAA-GCT-3探针 : 5-FAM-CTG-GCC-ACC-ACT-TCG-A-BHQ1-3扩增非结构蛋白 nsP1 基因 107 bp 的片段。引物浓度为 40 moL/L，探针浓度为 10 moL/L。5.20 75% 乙醇：用无水乙醇和 DEPC 水配制，使用前预冷到 -20 。5.21 三氯甲烷：4 保存。5.22 异丙醇：4 保存。5.23 DNA 相对分子质量标准：分子量大小 100 bp2 000 bp 间的 DNA 片段，-20 保存。6 器材和设备6.1 包埋机。6.2 切片机。6.3 96 孔细胞培养板。6.4 倒置显微镜。6.5 荧光显微镜。6.6 恒温培养箱。6.7 普通冰箱和超低温冰箱。6.8 组织研磨器（处理方法参见附录 D）。6.9 离心机和离心管（处理方法参见附录 D）。6.10 PCR 扩增仪。6.11 荧光 PCR 扩增仪。6.12 水平电泳仪。6.13 微量移液器及吸头（处理方法参见附录 D）。6.14 凝胶成像仪。6.15 制冰机。7 临床症状一般表现为食欲减退，体型瘦长，昏睡，眼突，腹水以及出现粪便拖尾，无法保持在水中的位置，螺旋或绕圈地游动，或者在水底不动。病鱼心脏苍白，肠道空虚、有黄色黏液，体内脂肪很少， 有时在幽门、盲肠和四周的脂肪出现瘀斑出血。8 组织病理8.1 操作步骤取鱼的胰腺、心肌、骨骼肌，用 10% 甲醛（5.3）固定至少 24 h。固定好的组织按照常规石蜡切片方法制作切片，用苏木精 - 伊红（H & E）染色后封片，显微镜下观察。8.2 结果判定8.2.1 典型组织病理病变为胰腺外分泌组织丧失，心肌、骨骼肌坏死和炎症。8.2.2 检测样品中观察到典型病变，判定为阳性。8.2.3 检测样品中没有观察到典型病变，判定为阴性。9 病毒分离9.1 样品采集取样数量按 GB/T 18088 的规定执行，优先选取具有临床症状的个体，宜每 5 尾鱼一个小样。若有症状的鱼每 1 尾作为一个小样，体长 4 cm 的鱼苗取整条鱼，但如有卵黄囊需除去；体长 4 cm6 cm 的鱼苗取所有内脏和鳃；体长 6 cm 的鱼取鳃、心、肾。用于组织病理检查的，取胰、心肌、骨骼肌。9.2 样品处理对组织称重后，用组织研磨器制备组织匀浆，用孵育液（5.10）制备 2% 的组织悬液。于 15 孵育 4 h，或 4 孵育过夜。4 000 g 离心 15 min，收集上清液。9.3 病毒分离用孵育液（5.10）对 2% 组织匀浆上清液作两次 10 倍稀释，将 3 个稀释度的上清液分别接种到生长 24 h 以内的 CHSE-214 细胞单层中，每孔（2 cm2）最多接种 100 L。15 吸附 2 h3 h 后，吸去稀释液，加入细胞培养液（5.11），置于 15 培养。同时设置阳性对照和阴性对照。当样品来自 IPNV 的流行区，在接毒之前需将稀释液与适当浓度抗 IPNV 血清（中和效价不低于2000）等量混合，15 孵育 1 h。14 d 内每天用倒置显微镜观察。如果接种了待检匀浆悬液的细胞中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有 CPE 出现，则在培养 14 d 后用 CHSE-214 细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆悬液的细胞单层培养物冻融 12 次，以 3 000 g、4 离心 5 min，收集上清液，按 1 : 5 稀释，按照上文方法接到新的细胞中，每天用倒置显微镜检查。9.4 结果判定9.4.1 SAV 引起的 CPE 典型现象为出现核固缩、有空泡细胞的斑块，见附录 A 图 A.1。9.4.2 若阳性对照出现 CPE，而阴性对照未观察到 CPE，实验有效。9.4.3 若检测样品首次接种细胞或盲传后细胞出现典型 CPE，判定为阳性。9.4.4 若检测样品盲传后细胞仍未观察到 CPE，判定为阴性。10 间接免疫荧光10.1 操作步骤细胞接种病毒，于 15 培养 9 d11 d 后，去除细胞培养液，用 80% 丙酮洗涤一次，然后再加入 80% 丙酮，室温固定 20 min。去除 80% 丙酮，室温晾干 1 h（固定的细胞可以在 4 中储存 14 d）。加入用 PBS 梯度稀释后的抗 SAV 抗体，室温孵育 1 h。用 PBS（含 0.05% 吐温 -20）洗涤 3 次。加入FITC 偶联抗鼠二抗，室温孵育 1 h。用 PBS（含 0.05% 吐温 -20）洗涤 3 次，PBS 洗涤 1 次，在紫外光下观察。染色的样品应尽量避光。同时设置阳性对照和阴性对照。10.2 结果判定10.2.1 特异荧光为细胞质内的绿色荧光，见附录 A 图 A.2。10.2.2 若阳性对照观察到特异荧光，而阴性对照未观察到特异荧光，实验有效。10.2.3 检测样品中观察到特异荧光，判定为阳性。10.2.4 检测样品中没有观察到特异荧光，判定为阴性。11 RT-PCR11.1 RNA 抽提将出现 CPE 或培养 14 d 的细胞培养物冻融 3 次，以 3 000 g、4 离心 5 min，取 200 uL 上清加入到 1.5 mL 离心管。或取匀浆成糊状的组织样品 25 mg100 mg 加入到 1.5 mL 离心管。加入 1 mLTrizol，用枪头充分吹打均匀；加入 200 L 三氯甲烷（5.21），涡旋振荡 30 s ；12 000 g 离心 15 min ；取上层水相到新的 1.5 mL 离心管，加入 500 L 异丙醇（5.22），上下颠倒数次混匀，静置 10 min ； 12 000 g 离心 15 min ；弃上清，沉淀物用 1 mL DEPC 水配制的 75% 乙醇（5.20）洗涤；8 000 g 离心10 min ；弃上清，沉淀室温干燥 10 min ；加入 30 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。提取后的 RNA 应尽快用于逆转录合成 cDNA 模板。具备同样抽提效率的商业化 RNA 抽提试剂盒也同样适用。11.2 cDNA 模板制备取 18.5 L RNA 溶液，加 10 倍逆转录酶浓缩缓冲液（见附录 B 中 B.3）2.5 L、dNTP 1 L、RNA 酶抑制剂 1 L、逆转录酶 1 L、下游引物 1 L。混匀后，置 PCR 仪上 50 反应 30 min，95 反应10 min，-20 保存。11.3 PCR在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液（见附录 B 中 B.4）2.5 L、dNTPs 0.5 L、Taq 酶 0.5 L、上游引物和下游引物各 0.
