常用分子生物学技术的原理及应用（改）

第二十章常用分子生物学技术的原理及应用 子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性（见第二章）印迹技术探针技术核酸分子杂交 ( 利用 、分子杂交与印迹技术的原理复性在 性过程中，如果把不同 链分子放在同一溶液中，或把 在一起，只要在 单链分子之间有一定的 碱基配对 关系，就可以在不同的分子之间形成 杂化双链 ( 。变性后 链和 单异源 化双链异源 印迹技术（印迹技术（ g）定义将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。 探针 (p r o b e ) 指经过特殊标记的（已知序列的）核酸片段 ； 具有与待测核酸片段互补结合的特定序列； 可以用于检测核酸样品中的特定基因。 核酸探针的来源或种类 人工合成的寡核苷酸片段 克隆的基因组 c D N A 全长或者部分片段 段 探针标记物 放射性核素 生物素 荧光染料 标记探针的序列如果和 上的核酸序列互补，就可以结合到膜上的相应 带，经放射自显影或其他手段检测就可以判定膜上是否由于探针互补的核酸分子存在。探针技术分子杂交实验 过程d ）消化琼脂糖凝胶电泳 杂交32 针放射自显影胶片感光加重量吸潮纸转移缓冲液 滤纸硝酸纤维素膜凝胶滤纸转移放射自显影照片第 二 节聚合酶链式反应种可以将目的微量的 00万倍以上的技术以把 指定的基因片段 数 量放大百万倍染色体1993)一、基本工作原理以待 扩增的 模板 ，以一对分别与模板 3 和 5 端相互补的 寡核苷酸片段 为 引物 ，在 作用下，按照 半保留复制的机制 延模板链延伸直至完成新的 重复这一过程，可使目的 一） 缓冲液热 异性引物一对分别与待扩增 模板 品待扩增片段（二） 延伸72循环2530次使模板 时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除使引物和模板底物催化次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环第一轮循环5/ 3/3/ 5/5/5/5/5/引物 变性（ 95 ）6075859590807065555045403530退火（ 60 ）延伸（ 72 ）变性（ 95 ）退火（ 60 ）延伸（ 72 ）5/5/5/5/温度5/变性（ 95 ）退火（ 60 ）延伸（ 72 ）温度二次循环 第三次循环 第四次循环待扩增序列引物 3/ 5/3/5/5/3/5/3/因突变检测基因的体外突变目的基因的扩增因文库（ 因文库包括：基因组 指包含了某一 生物体 全部 、基因组 以 包括所有的编码区和非编码区。 文库中包含的噬菌体克隆数代表基因组 基因组 噬菌体克隆数应在106以上才能包含该基因组 99%的 基因组文库的形式是 一群含有某细胞 制酶切位点限制酶消化除去中间片段 R 左臂R 0 段 R 0 源 段基因文库二、 包含 某一组织细胞在一定条件下所表达的全部 它以 求克隆数在 106以上才可能包含来自细胞内低丰度的 、基因文库的构建与筛选转录合成 NA 得目的基因细胞质粒噬菌体噬菌体粘粒酵母人工染色体20得目的基因从 表达型载体构建的 库还可以用特异性抗体或特异性结合蛋白筛选目的基因。