药学实用仪器分析(课件)液相色谱法

色谱通论&液相色谱§ 1 概述§ 2 色谱法基本原理§ 3 发展概况 (自学 )§ 4 柱色谱§ 5 薄层色谱法§ 6 薄层扫描法§ 7 纸色谱法本章小结§ 1 概述一. 色谱法 (义 ：利用各组分物理化学性质的不同 ，在流动相流经固定相时 ， 由于各组分在两相间的吸附 、 分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动 ， 最终达到分离的目的 。分离基础 ：差速迁移 (例 :赛跑 )特点 ：效率高，灵敏度高，能把性质相近的物质彼此分开，适合于干扰组分存在的混合物的分离分析。二、分类(一 ) . 以两相所处的状态分类：流动相 固定相 类型 ). 按分离机理分类：(1). 吸附色谱 : 利用吸附剂表面对不同组分吸附力不同而分离 。 (L S 色谱 g 固定相为固体吸附剂的色谱(2). 分配色谱 : (L L , g L). 利用各组分在两相间分配系数不同进行分离。(3). 离子交换 : 利用不同组分对离子交换剂亲和力不同分离。(4) 利用某些凝固对不同组分因分子大小不同而阻止作用不同 ， 进行分离 。(三 ). 按操作类型分类：柱色谱 ( 气相 、 高效 、 超临界流体 、 经典柱等等 。平面色谱 (：薄层 、 纸色谱 属液相色谱 ， 目前已很少使用 。§ 2 色谱法基本原理一 . 色谱过程：物质分子在相对运动的两相间 ， 分配 “ 平衡 ” 的过程 。前面已讲其分离机制是差速迁移 。例 ：顺 、 反偶氮苯在柱中吸附解吸附 ， 再吸附 1 + 2柱中填氧化铝 ,将正 、 反体溶液加入流动相中冲洗 ,经吸附 ,解吸附 1212流出曲线 :二 . 分配系数与保留行为的关系：1. 分配系数 ： 柱中分配平衡后 ， 组分在固定相与流动相中的浓度之比 。K = 固定相 m 流动相 有关 。对于不同的分离机理 ， 吸附色谱 称 吸附系数分配色谱 称 分配系数离子交换色谱 称 离子交换系数分子排阻色谱 称 分子排阻系数2. 保留时间： 从进样到某组分色谱峰峰顶的时间间隔 ，为该组分的保留时间 （ 。统称 从进样到某组分色谱峰峰顶所需流动相的体积为该组分的保留体积 时间： 不保留组分 (不 与固定相作用的组分 )的保留时间为死时间 流动相的保留时间 )。死体积： 同样组分 ， 在同样色谱条件下 ， 相同 。3. K 的关系：设 R为一个分子在流动相中出现的几率 , 则固定相中 1 R 。( 1- R) / R = 1/ R = 1+ 色谱基本关系式之一在一定的色谱条件下 , 呈线形关系 。组分的 后洗脱 (后出峰 )。组分的 先洗脱 (先出峰 )。混合物中各组分 各组分愈易彼此分开 。 流动相 、 固定相 、 的性质和温度有关 。 而在色谱条件一定时 , 因此 , 性参数 。)1(§ 4 柱色谱配柱色谱、离子交换柱色谱等。一 . 液 固 吸附柱色谱 :固体吸附剂 : 是一些多孔性物质 ,表面布满吸附点位 (吸附中心 )。吸附 : 溶质在液 固 、 气 固 两相交界面上集中浓缩的现象 。它发生在固体表面上 。(一 ) 色谱分离过程 :X : 样品中各组分分子 Y : 流动相分子流动相中溶质 吸附剂表面的流动相分子 吸附剂吸附的溶质分子 流动相由 m nY a X a nY m + 吸附 解 吸附 吸附平衡常数 : 由于流动相分子是大量的 ,所以 可视为常数。 吸附常数组分 (组分易被吸附 ,移行速度慢 ,保留值就大 )。洗脱曲线 :K a = X a Y m n X m Y a )吸附等温线一定温度 ,某组分在吸附剂表面吸附平衡 ,该组分在两相中的浓度相关曲线。1、 直线形等温线 是理想等温线 ,其所对应的色谱峰为对称峰 。 即吸附剂表面没被溶质所饱和 ， 斜率 K=m， 组分流出速度不受浓度的影响 。 峰前不变形 ， 后不拖尾 。2、 凸形 ：由于固体吸附剂表面活性不同 ， 大多数液相色谱非线形 ， 且凸形较多 。 吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附点位 ， 溶质在其表面的分配系数不同 。 溶质分子先占据强吸附点位 ， 然后再占据次强的 、 弱的 、 最弱的 。强的吸附点位被饱和 ， 在洗脱过程中 ， 被强吸附的溶质洗脱较慢 ， 所以其洗脱峰呈拖尾峰 。 （ 减少进样量 ）3、 凹形 ：由于进样量较大 ， 影响了固定相的物理性质 。 随溶质量的增加 , 所以呈凹形 。为防止流出曲线变形 、 拖尾 ， 应控制溶质进样量 。(三 ). 吸附剂的选择和吸附活度：1. 对吸附剂的要求：(1)表面积大 ， 具有一定的吸附能力 。(2)不应与流动相发生化学反应 。(3)粒度要细 ， 一般要 200目 。2. 吸附剂： 常用的有：氧化铝 、 聚酰胺 、 硅胶等 。酸性 5 4 分离酸性物质 . 如氨基酸(1) 中性 化铝 分离生物碱 . 如挥发油 ,甾体等碱性 9 10 分离碱性 . 如生物碱(2) 硅胶 : 吸附能力稍弱于氧化铝 ,用于分离弱酸活中性物 (如有机酸 、 氨基酸 、 甾体等 )。 硅醇基是使硅胶有一定吸附能力的活性基团 。三种存在形式 :S i O H S OS OS i 自由型 束缚型 活泼型 (3) 聚酰胺 :由酰胺聚合而成的高分子物质。其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基 ,可与酚 、 酸 、 硝基化合物等形成氢键 。 吸附力与能形成氢键的基团有关 。对位间位取代基均能形成氢键的 ,吸附力增大 。 邻位基团间能形成分子内氢键的 ,吸附力减小 。 芳香核具有较多共轭键时 ,吸附力增大 。C H 2C H 2C H 2C H 2C H 2 吸附剂的活度：氧化铝 、 硅胶的吸附力的大小 , 与其含水量有较大的关系：活度级数 含水量 活度 吸附能力小 少 大 强大 多 小 弱活化： 105 110 加热除水为活化 。脱活：加一定水份 ， 降低活性 。4. 薄层色谱法测 把柱色谱法配置的染料溶液点在待测活性的氧化铝薄层板上 (软板 ), 每种点2 4g , 用石油醚展开 , 展距 10观察染料斑点中心移动距离在 1 则此吸附剂为 级 。(四 ) 流动相的选择 :流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。要求 : 1. 纯度高 2. 稳定 (对样品和吸附剂不反应 )3. 对样品溶解度大 4. 粘度小 (易洗脱 )。选择流动相应考虑三方面：1. 被分离物质的极性与结构 :(1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大 。基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大 。常见的取代基极性大小顺序 :烷烃 1 , 说明 B+ 较牢地结合在树脂上 < 1 , 说明 A+ 较牢地结合在树脂上所以 说明了树脂对 A+、 B+两种离子选择性交换的能力 ,故也称之为 选择性系数 。 , 洗脱慢 , 。K B / A = B+ A+r A+ B+ A + B + R B + A + +2. 选择性系数与分配系数的关系 :即 : 分配系数不同是离子交换分离的先决条件。K B / A = B+ A+r A+ B+ r=§ 5 薄层色谱法 铺板 - 活化 点样 饱和 展开 显色 定性 , 定量 。一 . 原理 :将混合组分的试液 , 点在铺了吸附剂的玻璃板一端 , 在密闭容器中用适当的溶剂 (展开剂 、 流动相 ) 展开 , 各组分不断地被吸附 , 解吸附 随展开剂前移 , 利用吸附剂对不同组分的吸附力 (吸附常数 )不同 , 产生差速迁移 , 而达到分离 。特点 : 快速 、 灵敏 (几几十微克 )、 高选择 、 显色方便 。平面色谱 （ ( 参数 : (一 ) 定性参数 : 比移值a / c b / 0 未移行 (被固定完全吸附 , K ) 1 移至前沿 (组分不被固定相吸附 , K 0 )一般 : 0 1 在同一色谱条件下 , 同样结构 的分子由相同的 (例 : 点到斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离=R 当色谱条件一致时 ， 定性用 ， 但重现性差 。 可用相对可比值定性 。参考斑可以是另加的物质 ,亦可以样品中另一组分为参考。 主要取决于该组分在两相间的分配系数 , 因此 :薄层板的死体积 ; 板固定相体积 ;K: 该条件的分配系数物质极性大 , 吸附力强 ; 反之 , 物质极性小 , 吸附力弱 。 也可控制在 点到斑点中心的距离原点到参考斑的中心距 离R s=V mV m + K V sR f =11(二 )分离参数 : 分离度 (R)扫描测定 )。 一般亦可用纵向直径 。（三）容量因子 (相平衡参数X 1 21 2 2( ) /R = )1( 三 . 固定相 (. 吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用 , 但薄层色谱所用的硅胶、 胶 40 m (一般要求 200目左右 )常用硅胶 吸附剂 (硅胶 )、 粘合剂 (石膏 ),掺入荧光剂 254 黄绿色 。符号 : 硅胶 G 硅胶 + 石膏硅胶 H 硅胶 (未加任何物质 )硅胶 胶不含粘合剂 +荧光物质硅胶 胶 +石膏 +荧光物质2. 铺板 :常用平滑的玻璃板 ,洗净待用。软板 : 吸附剂直接铺涂 。 最大缺点 , 风吹即飞 (已不用 )。硬板 : 吸附剂 +粘合剂 糊状 铺板 凉干 活化常用粘合剂 : 羧