类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, April 25; 27(4): 653658 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjbim.ac.cn ©2011 CJB, All rights reserved. Received: June 13, 2010; Accepted: October 20, 2010 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20806031), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2009J01030). Research Foundation for Advanced Talents of Huaqiao University (No. 10BS220). Corresponding author: Guangya Zhang. Tel: +86-595-22690290; E-mail: zhgyghhhqu.edu.cn 国家自然科学基金 (No. 20806031)，福建省自然科学基金 (No. 2009J01030)，华侨大学高层次人才科研启动项目 (No. 10BS220) 资助。 生物技术与方法类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应 黄凯宗，李晶晶，李巍，葛慧华，王文研，张光亚 华侨大学生物工程与技术系，厦门 361021 摘 要: 旨在克隆、表达与纯化类弹性蛋白多肽，并测定类弹性蛋白的相变温度对不同的盐敏感程度。从头设计了类弹性蛋白多肽的序列并人工合成其编码基因片段，克隆至改造后的表达载体 pET-22b(+) 中，构建重组表达载体，转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 中并诱导表达，采用可逆相变循环经高速离心对其进行纯化，并考察了盐类型及浓度对类弹性蛋白相变温度的影响。结果表明：0.4 mmol/L 的 Na2CO3能使 25 mol/L 类弹性蛋白多肽 KV8F-20 相变温度降低至19 ，此类弹性蛋白多肽序列有望开发成一新型纯化标签，为今后重组蛋白的非色谱分离纯化奠定基础。 关键词: 类弹性蛋白多肽，非色谱法纯化，可逆相变循环，相变温度，纯化标签 De novo design, non-chromatographic purification and salt-effect of elastin-like polypeptides Kaizong Huang, Jingjing Li, Wei Li, Huihua Ge, Wenyan Wang, and Guangya Zhang Department of Bioengineering and Biotechnology, Huaqiao University, Xiamen 362021, China Abstract: Elastin-like polypeptides (ELPs) are temperature sensitive biopolymers composed of a Val-Pro-Gly-Xaa-Gly pentapeptide repeat that derived from a structural motif found in mammalian elastin. It was a promising tag for recombinant protein purification. Here, we de novo designed a novel ELPs gene and cloned it into the modified expression vector pET-22b(+). Then, we transformed the recombinant expression vector pET-22b-ELPs into Escherichia coli BL21(DE3). Upon induction by Isopropyl -D-Thiogalactoside (IPTG), ELPs was expressed and purified by a non-chromatographic purification method named inverse temperature cycling. The influences of salts types and concentrations on ELPs were also determined. The results showed that the transition temperature of the KV8F-20 decreased to 19 °C by 0.4 mmol/L Na2CO3. Due to its small molecular weight and sensitivity to salt, the ELPs might be a useful purification tag, which can provide a reliable and simple non-chromatographic method for purification of the recombinant protein by inverse transition cycling. Keywords: elastin-like polypeptides, non-chromatographic purification, inverse transition cycling, transition temperature, purification tag 654 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2011 Vol.27 No.4 Journals.im.ac.cn 蛋白质分子大规模分离纯化是当前生物工程中的关键技术问题，纯化过程所需成本约占总成本的 6070，色谱法为目前分离蛋白较成熟的方法。融合标签技术极大地简化了重组蛋白质的纯化过程， 它通过融合一段特定的多肽 (如组氨酸标签) 进行融合表达，并通过适当的亲和力或者对配体有高特异性，融合蛋白可以与固相基质上的特异配基结合，从而使重组蛋白质得以纯化1。但在实际应用中，亲合色谱法成本很高，不仅需要特殊设备，须对固相基质进行定制，难以放大到工业规模，且纯化效率低2。 类弹性蛋白多肽 (Elastin-like polypeptides，ELPs) 是一种具有弹性功能且对环境温度非常敏感的人造基因工程蛋白质聚合物。其结构主要由五肽重复序列单元构成，即 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)，源自于弹性蛋白的疏水区域，其中 Xaa可以是除 Pro 以外任一氨基酸。 ELPs 有一个可逆相变过程，称之为反转变温度 (Inverse temperature transition， ITT)， 若 环 境 温 度 低 于 该 相 变 温 度 (Transition temperature)，该多肽在水溶液中为高度可溶，聚合物链保持无序结构，且相当伸展。相反，当温度高于该温度时， 该含水的多肽链结构就瓦解，并开始聚集，形成一个富含 ELPs 的聚集物，由于ELPs 具有这种特殊性质，已广泛应用于蛋白质纯化与质粒 DNA分离3-8。 本研究设计了一新型 ELPs (即ELPKV8F-20)，人工合成其基因，成功在宿主菌表达并纯化，同时测定其对盐的敏感程度，为下一步纯化重组蛋白提供了理论与实验依据，报道如下。 1 材料与方法 1.1 ELPs 的命名 ELPXiYjZk-n 代表整个 ELPs 序列中有 n 个五肽，五肽中第 4 个氨基酸残基组成比例为 X:Y:Z= i:j:k2。 如 ELPKV8F-20， 是一个包含 20 个 VPGXG 五肽单元序列，五肽单元第 4 个氨基酸残基组成为K、V、F，且五肽单元第 4 个残基中含 2 个 K，16个 V，2 个 F，比例为 1:8:1。 1.2 菌株、质粒与培养基 表达宿主菌 E. coli BL21 (DE3) 与 pUC-19-ELPs及修饰后的 pET-22b(+) 为本实验室保存， 表达载体pET-22b(+) 为上海捷瑞生物工程有限公司惠赠。pET-22b(+) 的 修 饰 过 程 为 用 CATATGAGCAAA GGGCCGGGCTGGCCGTGATAAGAATTC 替换原始 pET-22b(+) 的 Nde与 EcoR酶切位点之间的序列。 1.3 主要工具酶及试剂 限制性内切酶 PflM、Bgl、Nde、EcoR与 Sfi购自上海捷瑞生物工程有限公司，蛋白质Maker SM1861 为 Fermentas 公司产品，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于碧云天生物技术研究所，聚乙烯亚胺购于 Sigma 公司，透析袋为美国联合碳化公司产品，其他化学试剂均为分析纯。 1.4 ELPs 的原核表达载体构建 本文所涉及到的分子生物学技术，如感受态细胞的制备、转化、质粒的提取和酶切等方法均参考文献9。用 PflM与 Bgl双酶切 pUC-19-ELPs，获得 ELPs 片段基因， 将此片段基因插入到经 Sfi酶切后 pET-22b(+) 修饰表达载体。重组质粒命名为 pET-22b-ELPs，测序鉴定由上海捷瑞生物工程有限公司完成。 1.5 ELPKV8F-20 表达与纯化 含有 pET-22b-ELPs 重组质粒的 BL21 工程菌按1100的接种量接种到含 100 g/mL氨苄青霉素的TB 培养基中 (每升 TB 培养基中含 12 g 蛋白胨，24 g 酵母浸提物，2.31 g 磷酸氢二钾，12.54 g 磷酸二氢钾，4 mL 甘油)，37 、250 r/min 培养至 OD600为 0.8 时，加入 IPTG 诱导 (终浓度为 1 mmol/L)，诱导 3 h，4 、4 000 r/min 离心 15 min，收获菌体，用预冷的 PBS 缓冲液 (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.2 mmol/L NaH2PO4，1.4 mmol/L KH2PO4，pH 为 7.3) 重悬菌体，然后置冰浴中超声破碎 (超声 2 s，间隔 2 s，共 4 min)。 黄凯宗等: 类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应 655 Journals.im.ac.cn ELPs 纯化采用 ITC (Inverse transition cycling，可逆相变循环)，即在大肠杆菌破碎液，向其加入聚乙烯亚胺 (终浓度为 0.5) 以去除核酸；4 、13 000 r/min 离心 15min，取上清；向上清液中添加 NaCl 至终浓度为 2 mol/L，37 水浴 15 min后，13 000 r/min 离心 15 min，去上清；向沉淀中加入预冷的 PBS 溶解沉淀，冰浴 15 min 后，4 、13 000 r/min 离心 15 min；向上清液中再添加NaCl 至终浓度为 2 mol/L，37 水浴 15 min 后，13 000 r/min 离心 15 min，去上清；向沉淀中加入预冷的 PBS 溶解沉淀， 冰浴 15 min， 4 、 13