4张杰-第12届生物农药大会-高效广谱Bt工程菌G033A创制与应用--2021-04-15--张杰

第十二届生物农药发展与应用交流大会第十二届生物农药发展与应用交流大会中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室张 杰2021.4.15高效广谱高效广谱BtBt工程菌创制工程菌创制与与应用应用 报告内容二三一工作思路研究进展未来展望（一）针对我国重要害虫开展工作u 农药政策，作物结构，栽培耕作，农药政策，作物结构，栽培耕作，灌溉，秸秆灌溉，秸秆还田还田害虫耐药性害虫耐药性抗性小菜蛾抗性小菜蛾等等作物结构调整作物结构调整棉铃虫、黄曲条跳甲棉铃虫、黄曲条跳甲等等刺吸式害虫刺吸式害虫稻飞虱、蚜虫稻飞虱、蚜虫等等外来入侵害虫外来入侵害虫马铃薯甲虫、草地贪夜蛾、马铃薯甲虫、草地贪夜蛾、番茄潜叶蛾番茄潜叶蛾等等新的新的灾害灾害农艺措施改变，地下害虫农艺措施改变，地下害虫蛴螬、黄曲条跳甲、韭蛆、线虫蛴螬、黄曲条跳甲、韭蛆、线虫等等 长期长期忽视、高毒农药禁用，缺乏农药，危害日益严重忽视、高毒农药禁用，缺乏农药，危害日益严重一、工作思路中华人民共和国国务院令第725号农作物病虫害防治条例2020.5.1 实施学 名：Spodoptera frugiperda,草地贪夜蛾，也称秋黏虫原 产 地：美洲热带和亚热带地区危害损失重：苗期到穗期均可危害，减产20%-40%，严重时绝收迁飞距离远：成虫每昼夜能飞100-500公里，最远1600公里繁殖能力强：雌虫平均产卵1000粒，最多达1500粒药剂防效差：市场上多数杀虫剂对其无效FAOFAO：全球十大害虫之首：全球十大害虫之首1.草地贪夜蛾草地贪夜蛾2020年我国草地贪夜蛾发生危害情况发生危害最终的五个省区发生危害最终的五个省区:u云南(1196万亩)u广西(206万亩)u四川(185万亩)u广东(152万亩)u湖北(121万亩)境内外虫源双重叠加虫源基数较高、北迁时间提早、发生面积扩大在27个省1409个县发生2070万亩，防治2800万亩n1993年马铃薯甲虫传入新疆后仅在边境地区霍城、察布查尔、伊宁、塔城4个县（市）危害。1995年已分布到伊犁、塔城两地的13个县（市）。1996年6月疫情形势出现重大变化，马铃薯甲虫越过伊犁、塔城盆地天然屏障，首次出现在乌苏市郊。至此，该虫进入天山北坡无屏障地带，沿着马铃薯种植带迅速东进。1999年到达乌鲁木齐2.2.马铃薯马铃薯甲虫3.3.黄曲条跳甲黄曲条跳甲蛹蛹幼虫幼虫幼虫幼虫成虫成虫成虫成虫u1901年年，在日本在日本首次首次发现发现Btu1911年年德德国国科科学学家家恩恩斯斯特特贝贝尔尔林林纳纳（Ernst Berliner）在在德国图林根德国图林根州州（Thuringia），从患有），从患有Schlaffsucht疾病的疾病的 地中海粉蛾幼虫（地中海粉蛾幼虫（Anagasta ruchniela）中发现并首次分离中发现并首次分离 到这种产伴胞晶体的芽胞杆菌，并证明其对部分鳞翅目昆到这种产伴胞晶体的芽胞杆菌，并证明其对部分鳞翅目昆 虫具有杀虫活性虫具有杀虫活性u1915年定名为年定名为苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）1.BtBt的发现的发现（二）苏云金芽胞杆菌简介一、工作思路晶体形状主要有：晶体形状主要有：菱形、球形、方形、菱形、球形、方形、不不规则形、米形、米粒粒形等形等u此晶体蛋白随芽胞的此晶体蛋白随芽胞的释放而放而释放到胞外，放到胞外，对多种昆虫多种昆虫具有特异的具有特异的杀虫活性虫活性。uBt转基因作物中利用的就是编码杀虫晶体蛋白的基因转基因作物中利用的就是编码杀虫晶体蛋白的基因方形方形菱形菱形菱形菱形不不规则形规则形方形方形米米粒粒形形Cry1 Cry1 晶体晶体 2 2 微米微米2.Bt 2.Bt 杀虫蛋白杀虫蛋白u19381938年，在法国开始产业化应用，广泛用于农业、林业和卫年，在法国开始产业化应用，广泛用于农业、林业和卫生害虫的防治生害虫的防治;应用应用8383年年,全球产量最大、应用最广的微生全球产量最大、应用最广的微生物杀虫剂，市场份额最高物杀虫剂，市场份额最高90%90%u目前全球销售额稳定目前全球销售额稳定在在2 2亿亿美元美元u武汉（湖北农科院武汉（湖北农科院/华中农大），华中农大），中国中国BtBt先驱，先驱，5050年代年代u鼎盛期在鼎盛期在9090年代，目前年代，目前8 8千万千万11亿元亿元RMBRMBu20202020年年1010月，登记月，登记240240个产品：个产品：鳞翅目、双翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目鞘翅目3.Bt3.Bt杀虫剂产业化杀虫剂产业化改造基因改造基因结构域互换结构域互换不同杀虫谱不同杀虫谱基因组合基因组合发现新菌株发现新菌株克隆新基因克隆新基因改造基因改造基因细胞胶囊细胞胶囊抗紫外物质抗紫外物质新的剂型新的剂型毒力毒力杀虫谱杀虫谱药效期药效期（三）Bt存在问题与解决策略一、工作思路菌株分离菌株分离基因克隆基因克隆基因改良基因改良调控网络调控网络B Bt t资资源源发发掘掘B Bt t功功能能基基因因组组虫虫 害害 绿绿 色色 防防 控控高效高效工程菌工程菌高毒高毒BtBt菌株菌株转基因抗虫转基因抗虫植物植物BtBt存在问题与解决策略存在问题与解决策略69%4%6%21%小于小于45%45%至至78%78%至至95%大于大于95%33%17%15%14%7%6%2%PioneerMonsantoAthenixDowMycogenSyngentaBayerBtBt杀虫基因克隆专利保护情况分析杀虫基因克隆专利保护情况分析专利库中杀虫基因序列分析专利库中杀虫基因序列分析BtBt杀虫基因专利权人分析杀虫基因专利权人分析Coteva柯迪华柯迪华：47%Bayer-Monsanto:41%先正先正达达：6%孟山都 对鳞翅目昆虫Bt基因专利1998.12.17申请2007.10月授权我国获得的一个Bt基因专利中国农科院生物技术所郭三堆研究员，1998年4月授权孟山都 公司：对马铃薯甲虫高效的cry3Aa基因的专利，在美国-申请日期：1987.4.29，授权时间：1989.12.11在中国-申请日期：1988.4.28，授权时间：1994.11.9美国人u全球战略眼光u全球规划布局u全球知识产权战略和创新意识 值得我们学习、反思和警惕基因名称基因名称Acc No.发现者者年份年份Cry1Ie1AAG43526Song et al2000Cry1Ie2HM439636Liu et al2010Cry1Ie3KC156647Sampson et al2012Cry1Ie4KC156681Sampson et al2012Cry2Ah1EU939453Zhang et al2011Cry2Ah4KC156702Sampson et al2012Cry7Da1ACQ99547Yi et al2012Cry7Da2HM572236Shu et al2010Cry7Da3KC156679Sampson et al2012Cry7Fb1HM572235Shu et al2010Cry7Fb2KC156682Sampson et al2012Cry7Ga1HM572237Shu et al2010Cry7Ga2KC156669Sampson et al2012Cry9Ee1GQ249296Su et al2009Cry9Ee2KC156664Sampson et al2012效率效率是核心竞争力是核心竞争力BtBt资源需要资源需要采集分离才能获得采集分离才能获得遵循知识创新的先占性原则；遵循知识创新的先占性原则；地域分布差异不明显地域分布差异不明显目前广泛应用的目前广泛应用的C Cry1Ary1A高毒杀高毒杀虫基因在世界各地都有分布；虫基因在世界各地都有分布；我国先克隆到的新型模式基因我国先克隆到的新型模式基因类型在国外也有发现类型在国外也有发现提高资源发掘速度与效率是目提高资源发掘速度与效率是目前与国外竞争的唯一手段前与国外竞争的唯一手段BtBt资源兼具矿藏资源与知识创新的双重特点资源兼具矿藏资源与知识创新的双重特点种子种子种子种子/卡脖子技术：卡脖子技术：卡脖子技术：卡脖子技术：BtBtBtBt菌株和基因专利保护刻不容缓菌株和基因专利保护刻不容缓菌株和基因专利保护刻不容缓菌株和基因专利保护刻不容缓高效菌高效菌株筛选株筛选构建工构建工程菌株程菌株安全性安全性评价评价产品产品登记登记推广推广应用应用Cry3Aa,Cry3Aa,方形晶体方形晶体Cry1Cry1，双锥体形晶体，双锥体形晶体二、研究进展 （一）（一）高效高效广谱广谱BtBt工程菌工程菌G033AG033A研制研制1 1）土壤样品采集）土壤样品采集自然保护区自然保护区农田农田n每年采集土壤样品10000份 2 2）菌株）菌株分离与筛选分离与筛选n分离、保存分离、保存1500015000个个BtBt菌株菌株n建立了菌株管理数据库系统建立了菌株管理数据库系统BtBt菌株分离鉴定菌株分离鉴定3）对叶甲科高毒力的Bt 杀虫基因 cry3AaG03 G033ABt22 从从菌菌株株Bt22Bt22克克隆隆了了cry3Aacry3Aa 基因基因该该基基因因对对鞘鞘翅翅目目叶叶甲甲科害虫高效毒杀科害虫高效毒杀 方形方形晶体晶体Bt22原子力显微镜观察晶体（原子力显微镜观察晶体（2 2微米）微米）4）工程菌的构建遗传遗传稳定稳定性性载载体体构构建建工工程程菌菌构构建建工工程程菌菌检检测测thyA、KmrpSTKpSTK-3AG03 受体菌受体菌Err、AmprpSXY422bcry3Aa工程菌工程菌生长生长特性特性生物生物活性活性生物生物安全安全性性发酵发酵工艺工艺特性特性G03 G033ABt22 4 4）工程）工程菌株构建菌株构建 两种两种启动子，不同时间表达，避免营养竞争启动子，不同时间表达，避免营养竞争cry3Aa 基因 供体菌株Bt22 对鳞翅目害虫高效受体菌株G03G033A工程菌株Pcry3A：8hr 表达Pcry1/2：20hr表达导入获得原子力显微镜观察晶体（原子力显微镜观察晶体（2 2微米）微米）Cry3Aa,Cry3Aa,方形晶体方形晶体Cry1Cry1，双锥体形晶体，双锥体形晶体G033AG033A工程菌杀虫蛋白晶体工程菌杀虫蛋白晶体5)G033A5)G033A产品质量控制产品质量控制-杀虫蛋白含量检测杀虫蛋白含量检测G033A菌株表达的杀虫蛋白菌株表达的杀虫蛋白SDS-PAGE分析分析1，G033A蛋白原液；蛋白原液；2，G033A蛋白原液稀释蛋白原液稀释2倍；倍；3，G033A蛋白原液稀释蛋白原液稀释4倍；倍；4，G033A蛋白原液稀释蛋白原液稀释8倍；倍；5，G033A蛋白原液稀释蛋白原液稀释16倍；倍；6，G033A蛋白原液稀释蛋白原液稀释32倍。倍。Cry1AcCry3AaG033A菌株表达菌株表达3种种杀虫蛋白：杀虫蛋白：Cry1Ac/1Ca和和Cry3Aa晶体含量检测晶体含量检测:测定结果：测定结果：G033AG033A原粉中原粉中Cry1Cry1蛋白含量为蛋白含量为5.1%5.1%Cry3Aa Cry3Aa蛋白含量为蛋白含量为4.6%4.6%6)G033A6)G033A产品质量控制产品质量控制-活性检测活性检测不同浓度的不同浓度的G033AG033A原粉及制剂对原粉及制剂对小菜蛾小菜蛾的杀虫活性分析的杀虫活性分析生测结果显示：生测结果显示：在剂量在剂量50 g/15 L G033A原粉原粉/制剂制剂下，小菜蛾虫下，小菜蛾虫体变黑，已全部致死体变黑，已全部致死，甘蓝甘蓝叶片叶片几乎未取食。几乎未取食。生测结果显示：生测结果显示：在剂量在剂量100 g/15 L G033A原粉原粉/制剂制剂下，下，猿叶甲死亡率达猿叶甲死亡率达90%以上以上，油菜叶片，油菜叶片几乎未取食几乎未取食不同浓度的不同浓度的G033AG033A原粉及制剂原粉及制剂对大对大猿猿叶甲叶甲的杀虫活性分析的杀虫活性分析G033AG033A产品质量控制产品质量控制-活性检测活性检测 7)G033A 7)