基因工程6转基因体的检测

第五章：转基因体的鉴定验证, 外源基因是否进入受体细胞？, 进入受体细胞的外源基因是否整合到染色体上？, 整合的方式如何？, 整合到染色体上的外源基因是否表达？,这一系列的问题仍需回答，只有获得充分的证据后才可队定被检的材料是转基因的。,外源基因整合的分子生物学鉴定主要有PCR扩增、PCR-Southern杂交、 Southern杂交以及Southern原位杂交和FISH等。,一、外源基因整合分子生物学鉴定,1 利用PCR扩增检测外源基因整合, 以被检植株DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增。, 琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。反之，非转化植株无特异性扩增条带出现。,通过特异性扩增条带的有无及其分子量的大小可对外源基因是否整合做一初步判断。,斑点杂交可以快速粗略地检测一下植物基因组内是否含有外源基因。,2 Southern斑点杂交,操作过程：植物总DNA或基因组DNA不经限制性内切酶酶切，直接点在固相膜上。点样前DNA样品需经变性处理，一般做法是采用NaOH碱变性，也可以通过煮沸变性。轻微洗膜除去盐后进行固定，以后的操作与印迹杂交相同。,斑点杂交的主要问题是假阳性率较高。,斑点杂交虽可以简便快速地检测植物染色体DNA中是否含有目的基因及大致的量，但不能反映外源基因整合的更多信息。,3 Southern印迹杂交,Southern印迹杂交由Southern于1975年建立，用来检测经限制性内切酶切割的植物DNA片段中是否存在与探针同源的序列，并可分析外源基因在植物染色体上的整合情况，如拷贝数、插入方式以及外源基因在转化植株Tl代中的稳定性等问题。,将被检植株的基因组DNA提取出来，用限制性内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有外源基因片段或含外源基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝胶上。,1）Southern印迹杂交原理,用碱处理凝胶，使各酶切片段在凝胶上原位变性，利用印迹技术将变性的各酶切片段由凝胶转移到固相膜上，各片段在固相膜上的相互位置与在凝胶上相同，实现所谓的原位印迹。,经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与固相膜牢固结合。,经预杂交处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点后，将膜放入含有单链或经变性处理成为单链探针的杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。,膜上与探针同源的单链序列，可通过碱基互补作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应位置上。外源基因与探针同源，凡含有外源基因序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异性杂交体。,漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离的探针。,最后根据探针的标记性质进行检出，特异性杂交体的数量及位置将清晰而准确地显示出来。,实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA样品及待检转化植株总DNA样品。,2）Southern印迹杂交的实验样品,阳性对照样品：含被检的外源基因的中间载体质粒DNA；或农杆菌共整合载体的Ti质粒DNA；或农杆菌双元载体小质粒DNA。,阴性对照样品：用相同方法提取的非转化植株总DNA。,分子量标准DNA样品：DNAHind、或DNAHindIII+EcoR I。,被检样品：各转化克隆植株总DNA。,3）Southern印迹杂交的实验程序,Southern印迹杂交需要依次完成如下8个实验步骤：植物总DNA的限制性酶切；凝胶电泳分离各酶切片段；各酶切片段于凝胶中原位变性；将凝胶中变性的DNA片段转移到固相膜上；预杂交，掩盖非特异性位点；探针与膜上同源DNA片段杂交；漂洗去除未结合的及非特异性结合的探针；杂交体检出。,各程序中有关问题阐述如下：, 植物总DNA的限制性酶切,* 限制性内切酶的选择,多数情况是对植物基因组DNA进行单酶切，也可进行双酶切。酶的选用原则是消化后生成的DNA片段可提供出与探针杂交所需的足够信息，即限制片段中必须含有整个探针序列。, 酶切反应体系,* 植物DNA的用量一般在515µg；* 酶切体积为20一50µl；* 酶的用量要比消化质粒DNA时高一些，一般为510U/µg DNA。,Notice: 限制性内切酶是保存在50的甘油中，如果酶切反应体系中甘油浓度超过5，则会引起限制性内切酶专一性改变，产生星活性。, 酶切效果检验,酶切体系及条件是否合适，需通过检测酶切效果来确定。,酶切充分的植物DNA产生若干大小不同的片段。将酶切样品用0.7或0.8的琼脂糖凝胶分离，电泳后在紫外灯下观察，酶切效果好的样品应呈现出一条连续的，荧光由深至浅的均匀条带(高分子量区深，低分子量区浅) 。, 凝胶中的DNA变性,Southern杂交必须是单链探针与单链同源DNA片段结合，因而凝胶上的双链DNA片段必需经变性处理，使之成为单链。通常采用碱变性，将凝胶浸泡在0.5molL NaOH、1.5mol/L NaCl溶液中，室温下于脱色摇床上轻摇，其间可更换一次变性液以使DNA充分变性，注意胶不要浮在液面上。, 印迹,Southern杂交是杂交液中的探针与固定在固相支特物上的同源序列进行的固液杂交。固相支持物也称固相膜或简称为膜。将凝胶上的变性DNA片段原位转移到固相支持物上的过程称为印迹。为满足印迹及杂交操作的要求，固相膜必需具有如下特点：, 能很好地与DNA分子结合，要求每平方厘米能结合10µg以上的DNA，同时又不影响DNA片段与探针杂交； 对探针及其它物质的非特异性吸附小； 具良好的机械性能。,印迹方法,第一、毛细转移法：该方法是利用干燥吸水纸的毛细作用进行转移。,第二、电转移法：电转移法是利用电泳的原理，凝胶上的DNA片段在电场作用下脱离凝胶，原位转至固相支持物上。,第三、真空转移法：真空转移原理是利用真空作用造成流经凝胶的液流，使凝胶中的DNA片段洗脱出来而沉积在凝胶下面的固相支持物上。, 预杂交,*预杂交：预杂交是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点。由于固相膜对单链DNA有很强的结合力，所以膜不仅能与印迹过去的样品DNA结合，而且也能与探针结合。在印迹后的膜上，除样品占据的位置外还有空余，如不将这些空余部位封闭，探针就会被结合，掩盖了特异性杂交。,常用的封闭剂有两类，一类是变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA等。另一类是高分子化合物，如聚蔗糖400(菲可)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、小牛血清白蛋白(BSA)，这三种试剂按一定比例配比，就构成Denhardts封闭试剂。此外，脱脂奶粉也可使用，还有使用肝素的报道。,预杂交操作是将印迹后的固相膜放在含有封闭剂的预杂交液中，于3742温育312小时。, 杂交与洗膜,Southern杂交是液相中的探针与固定在膜上的同源序列碱基配对形成异源双链的过程，杂交是以DNA的复性为理论基础。,杂交效果的好坏主要取决于杂交的特异性、灵敏性及杂交反应速度。它们受杂交体系中的探针浓度、样品浓度、温度、离子强度等多种因素的影响并与非特异性位点的封闭、非特异性杂交的消除直接相关。,*洗膜：洗膜是除去游离的及在非特异性位点上结合的探针。洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗膜效果的三要素。,通常采用低于特异杂交体Tm值1220的温度洗膜。,一般采用2XSSC0.1XSSC溶液洗膜，洗膜液中还经常加入5的SDS以促进非特异性杂交链的解离。降低洗膜液的离子强度可提高洗膜效果。, 杂交信号的检出, 放射性标记的探针通过放射自显影检出。非同位素标记的探针根据标记物的特有性质检出。,放射自显影 包括压片、显影、定影和水洗四步。,非放射性标记探针的检出,目前大多数非放射性探针的制备都是采用分子杂交与酶反应相结合的策略。杂交后杂交信号的检出依赖于酶反应。但除酶直接标记的探针可直接通过酶反应检测外，其它的非放射性标记物，如生物素、地高辛等标记探针的杂交信号均不能直接检出，要先使杂交体与酶标记的检出系统特异结合后，再通过酶反应间接检出。, Southern 印迹杂交结果分析,利用Southern印迹不仅可以分析出外源基因是否整合到植物染色体上，而且还可以对外源基因的整合情况进行分析，如整合的外源基因是单拷贝还是多拷贝，多拷贝的插入方式如何，是串联插入还是分散插入，串联的方式是同向还是反向等。,对于农杆菌介导的转化体，分析的基本方法是用重叠探针杂交，并以转化的外源基因不同拷贝数为对照。其原理是转化植株基因组DNA用限制性内切酶消化时，外源DNA序列会产生四种片段 。,内部片段：由外源DNA内的切点产生。边界片段：是外源DNA插入的末端片段。复合片段：这种片段与TDNA的左边界及右边界表现同源。重新编排的序列：这种限制性片段可能来自TDNA的重新编排或异常整合。也可能是正常整合后发生。,通过对转基因植物Southern印迹杂交的分析，可获得外源基因是否整合到植物基因组中、整合方式及拷贝数的信息。但对于外源基因在植物染色体上整合位点，即整合在哪条染色体的哪个位置上，印迹杂交就难以提供可靠的根据。 因此要想了解外源基因在植物染色体上的整合位置，就需要利用原位杂交（in situ hybridization, ISH）技术了。,4 Southern原位杂交,原位杂交即是通过杂交确定杂交体在样本中的原本位置。这里说的Southern原位杂交是确定外源基因在染色体上的位置，它基于处于分裂过程中的植物细胞染色体可以用光学显微镜观察到，并可以通过染色体的形状以及经不同染色后形成的条带分布来对各染色体进行鉴别及分析。原位杂交以标记的外源基因为探针，在适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，然后根据探针的标记性质进行检测，在显微镜下观察。,原位杂交包括取材及材料预处理、固定细胞、细胞的RNase酶解及染色体变性、杂交、检出五个程序。探针的制备与印迹杂交相同。在取材及材料处理上，因要观察的是细胞内的染色体，有丝分裂中期的染色体。取材时应取便于观察染色体的材料，如植物的根尖、茎尖、幼叶、幼小的子叶、茎形成层、居间分生组织、愈伤组织、花蕾、花粉、胚乳等，还要用化学或物理的方法对材料进行预处理，阻断纺锤体微管的形成，使有丝分裂停滞于中期，这样可以得到大量的供实验用的染色体。,目前原位杂交技术存在两个问题： 一是灵敏性不高。 二是有时会出现非特异性杂交。,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分 子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。,PCR-Southern杂交是一种近年来开始使用的检测外源基因整合的方法。该方法先对被检材料进行外源基因的PCR扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。,5 PCR-Southern杂交检测,1）转基因植株PCRSouthern杂交检测,（1）样品设置,为确保检测的真实性，除被检样品外，实验中应设置三个对照：空白对照：无任何DNA模板(反应体系中不加入任何模板DNA，其它试剂相同，主要检测反应体系中有无DNA污染)。阳性对照：以外源基因的质粒载体DNA为模板。阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。被检样品：以不同克隆系的基因组DNA为模板。,（3）印迹及杂交将扩增产物电泳后的凝胶碱变性处理后转移到固相膜上，以目的基因为探针进行杂交。操作程序和方法与Southern杂交相同。,（2）PCR扩增及产物电泳,（4）杂交结果凝胶中的特异性扩增条带能发生杂交。非特异性扩增条带不发生杂交，所以阳性对照应产生杂交带，非转化植株无杂交带。各被检植株样品中出现杂交带的可被确定为转基因的。,