细胞工程-试管动物与克隆动物
第十二章、试管动物与克隆动物第一节试管动物第一节试管动物1978年年7月月25日深夜时分，英国曼彻斯特日深夜时分，英国曼彻斯特郊外的奥德姆总医院里，一个女婴的啼哭郊外的奥德姆总医院里，一个女婴的啼哭声划破夜空，震撼了世界声划破夜空，震撼了世界她就是世界她就是世界上第一例试管婴儿上第一例试管婴儿路易斯路易斯.布朗。布朗。一、试管动物概念一、试管动物概念一、试管动物概念一、试管动物概念 将供体的精子和卵子在体外受精、体外培将供体的精子和卵子在体外受精、体外培将供体的精子和卵子在体外受精、体外培将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般都在试管内进行，所以称为都在试管内进行，所以称为都在试管内进行，所以称为都在试管内进行，所以称为“试管动物试管动物试管动物试管动物”。也。也。也。也有称为有称为有称为有称为“体外受精动物体外受精动物体外受精动物体外受精动物”。二、试管动物的培育流程二、试管动物的培育流程 精子的采集与体外获能处理卵子的回收与成熟培养卵子与精子的体外受精受精卵的体外发育试管胚胎的移植、精子的采集与获能处理n n精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。n n对于个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。人工阴道法n n人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间充以温水（充以温水（38384040），后端有精液收集管以），后端有精液收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。在公猪可以用猪用假阴道收阴茎上，使其射精。在公猪可以用猪用假阴道收集精液或用手握法采精，但仍需要台畜，使其爬集精液或用手握法采精，但仍需要台畜，使其爬上以遍进行操作。上以遍进行操作。n n另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的时间，即可射精而得到精液。时间，即可射精而得到精液。精液的保存n n精液的保存可以分为常温（精液的保存可以分为常温（15152525）、低温）、低温（0 05 5）和超低温冷冻（）和超低温冷冻（7979-196-196）三）三种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。活时间，尽量保存其受精能力。n n保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等。释剂、营养剂和保护剂等。n n稀释剂稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液，包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液，n n营养剂营养剂包括糖类、奶类和卵黄等，包括糖类、奶类和卵黄等，n n保护剂保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、油、DMSODMSO、糖类等。、糖类等。三种保存方法n n常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。n n低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。n n如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。n n对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。人为使得精子获能n n可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。n n而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。n n另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。、卵子的回收与成熟培养n n人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性腺激素或黄体激素释放激素（LHRH），对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵，排卵数目不变。n n以小鼠为例，通常可用35IU PMSG或23IU hCG或100g FSH 或100gLH或0.020.05g LHRH皮下或腹腔内注射，1214小时可以有70100正常排卵。采卵（）输卵管内采卵：（）输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。（）对于稍大一些的动物可以用（）对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵活体输卵管采卵，例，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下处下1cm1cm处，剪成处，剪成V V形小口，插入塑料细管，自伞形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。（3）对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。（）对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。卵母细胞一般检测n n得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查微镜下检查核和胞质发育的状况核和胞质发育的状况，如核的形态、位置，如核的形态、位置和所处的时期。和所处的时期。n n排出的卵母细胞，有多层排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞卵丘细胞包围，除去卵丘细包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。第二次成熟分裂中期。n n多数实验动物的卵母细胞胞多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状质呈透明状，但由于胞质，但由于胞质中中富含大量脂滴和空泡富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈，所以在镜下呈暗色暗色。n n各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为以分为优秀、普通、不良和异常卵优秀、普通、不良和异常卵。n n进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有体外面完整地包有3 34 4层卵丘细胞，卵母细胞胞质层卵丘细胞，卵母细胞胞质无斑块者为佳。无斑块者为佳。镜检卵母细胞n n如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。n n如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。、体外受精n n1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。n n1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。n n1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。过程获得获能的精子和成熟的卵母细获得获能的精子和成熟的卵母细胞后，应在塑料平皿底部，用已胞后，应在塑料平皿底部，用已经处理获能的精子浮游液经处理获能的精子浮游液5l精精子浮游液，注入小滴中，将成熟子浮游液，注入小滴中，将成熟培养后的卵母细胞，或自体内手培养后的卵母细胞，或自体内手术冲出的卵母细胞，以术冲出的卵母细胞，以BO液冲液冲洗，用微吸管吸洗，用微吸管吸10个卵母细胞与个卵母细胞与少量少量BO液注入精子浮游液小滴液注入精子浮游液小滴中。在中。在CO2培养箱中培养培养箱中培养7小时小时后再经微量吸管自小滴中用后再经微量吸管自小滴中用BO液多次冲洗以洗去多余的精子。液多次冲洗以洗去多余的精子。然后移入发育培养液（然后移入发育培养液（TCM19910FCS）继续培养。）继续培养。显微操作协助受精n n在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡作用。作用。n n19761976年，年，UeharaUehara和和YanagimachiYanagimachi将仓鼠或人的将仓鼠或人的精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注射、透明带钻孔和透明带部分切口等几种。射、透明带钻孔和透明带部分切口等几种。卵母细胞质内注射n n卵母细胞质内注射，是将整个精子或精子头部直接卵母细胞质内注射，是将整个精子或精子头部直接注射到卵母细胞质内。要求注射针的尖端必须锋利，注射到卵母细胞质内。要求注射针的尖端必须锋利，注射吸管内径通常为注射吸管内径通常为5 510m10m，并尽量避免液体，并尽量避免液体进入卵胞质。此方法可以使任何类型的精子如精子进入卵胞质。此方法可以使任何类型的精子如精子头形不正常、死精子或严重缺陷的精子等，可省去头形不正常、死精子或严重缺陷的精子等，可省去获能和顶体反应。获能和顶体反应。n n还可以将还可以将1 1个或多个精子注入透明带下，可以一步个或多个精子注入透明带下，可以一步直接将精子注射到卵周隙，也可以先将透明带钻孔直接将精子注射到卵周隙，也可以先将透明带钻孔或部分切口后，再进行精子注射。使用的精子应该或部分切口后，再进行精子注射。使用的精子应该是获能和发生顶体反应的。当然，当注射多个精子是获能和发生顶体反应的。当然，当注射多个精子时可能发生多精受精现象。时可能发生多精受精现象。单精子卵胞浆内显微注射单精子卵胞浆内显微注射其它一些方法n n如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后将吸满酸性台氏液（定住卵，然后将吸满酸性台氏液（pH2.5pH2.5）的微吸）的微吸管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流。管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流。当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗涤后，再用适当密度的精子进行受精。涤后，再用适当密度的精子进行受精。n n先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了超过超过3030的妊娠
