IP实验步骤 基本实验步骤

IP 实验步骤 基本实验步骤 (1）收获细胞，加入适量细胞 IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂） ，冰上或者 4裂解 30min， 12,000g 离心 30 min 后取上清；(2) 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液将 1g 相应的抗体和 10-50 l protein A/G-beads 加入到细胞裂解液，4°C 缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在 4°C 以 3,000 g 速度离心 5 min，将 protein A/G-beads 离心至管 底；将上清小心吸去，protein A/G-beads 用 1ml 裂解缓冲液洗 34 次；最后加入 15l 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮 10 分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting 或进行质谱分析。一、 样品处理： 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象 状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量， 浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads 孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在 冰上或者 4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的 RIPA 裂解液为例（主要含有 pH7.4 左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的 NaCl，一定比 例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们 如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a 缓冲液：离子缓冲液常采用 pH7.4 的 Hepes 或者 Tris-Cl。b NaCl 浓度一般习惯用 150 mM，这主要是因为 150 mM 接近生理浓度，不会破坏蛋白 质之间的相互作用。然而细胞内部的 NaCl 浓度并不是均一的，局部 NaCl 的浓度可以低到 50 mM，150 mM 的 NaCl 有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳 的 NaCl 浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加 10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其 中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活 性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制 环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降 解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加 EDTA 抑制金属蛋白酶，通过 Protease Cocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。e 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢 剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：- 细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释 放出来，抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的 免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。- 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据 具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白 质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂 种类和浓度。二、 抗体-agarose beads 孵育 裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80°保存 3 个月，但最好 能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads 孵育实验。抗体可以先加入 上清中与样品孵育数小时后再加入 Protein A 或者 G beads 孵育过夜，也可以同时加入抗体 和 Protein A 或者 G beads 孵育过夜。一般选择 1mg 总蛋白（1mg/ml）对应添加 1 ug 抗体， 最高可以添加至 5 ug 抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适 的阴性对照。一般选用加同样量的 IgG，但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的 蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白 A 的免疫沉淀，选择膜蛋白 B 来做阴性对照，只要确 认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白 C 的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋 白 D 来做阴性对照。同时，为避免 Protein A 或者 G beads 有（非）特异性吸附从而造成免 疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将 Protein A 或者 G beads 与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads 孵育。 同时，Protein A 或者 G beads 对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和 Ig 亚 型，选择合适的 Protein A 或者 G beads 也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。 一般推荐使用 Protein A 和 Protein G beads 的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省 去了许多选择的烦恼。三、 抗体-agarose beads 复合物洗涤： 除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的 一个办法是对抗体-agarose beads 复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样 的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求， 还可以通过更改 NaCl 的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。 例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白 质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的 SDS 洗涤抗体-agarose beads 复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定 免疫沉淀实验用途非常广泛（见 IP： Q&A） ，而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出 了许多免疫沉淀相关实验手段（比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和 RNA-蛋白免疫沉淀） ， 因此，免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的 WB 检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加 Protein A/G beads 与样品孵育，因此在最后离心获得抗 体-agarose beads 复合物后，eppendorf 管中主要含有抗体，目的蛋白，Protein A/G beads 以 及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及 Protein A/G beads 三者之间是 以非共价健结合在一起，只有 Protein A/G 与 agarose beads 是共价结合在一起的。因此，最 后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去 Protein A/G beads 后， eppendorf 管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样 SDS-PAGE 中就含有 目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之 间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子（55KD）和轻链分子（25KD） 。因此， WB 显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体 分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大 （1ug） ，所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的 WB 信号 常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的 WB 结果判断。针对上述情况，通常有二种解决办法： a 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和 WB 实验，这样再选择一个种属交叉反 应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行 WB 实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的 WB 信号。 b 使用交联剂将抗体和 Protein A/G beads 交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲 液处理目的蛋白-抗体-agarose beads 复合物，最后离心去除抗体-agarose beads 复合物，上 清中只留下目的蛋白。免疫沉淀（免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理）原理IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G“特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的 FC 片段的现象开发出来的方法。目前多用 protein A/G 预先结合在 argarose beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A/G 就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研 究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方 法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质 间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的 蛋白质 Y 也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。白与蛋白的相互作用 寻找新的相互作用蛋白 经由免疫共沉淀然后通过质谱或者WB 鉴定新的相互作用蛋白 验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用 经由免疫共沉淀然后通过使用待测蛋白的抗体进行 WB 实验可以确定目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用 研究蛋白与 DNA 的动态作用 通过对经由免疫共沉淀而得到的DNA 片段进行 PCR 实验可以获得DNA 片段的序列信息以及目的蛋白与 DNA 之间的动态作用信息 研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系 通过使用针对组蛋白不同修饰位点的抗体进行染色质免疫沉淀实验去检测组蛋白的不同修饰状态和目的基因启动子之间的动态相互作用，从而研究组蛋白修饰与目的基因表达之间的关系 染色质免疫沉淀 研究蛋白与 DNA的相互作用 研究蛋白与 RNA 的相互作用 基于 CHIP 的原理发展出来的RIP（RNA-IP）技术可以用来研究目的蛋白与 RNA 之间的相互作用信息 我该选择什么样的抗体做免疫沉淀，免疫共沉淀和 RNA 免疫沉淀以及染色质免疫沉淀？ 在所有免疫沉淀相关实验中，抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验（WB 和 IF 等）要低得多，所以对抗体的亲和力相对其它实验(WB 和 IF 等)提出了很高的要求，这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时，由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件性进行，所以需要抗体识别蛋白的天然表面构象，因此选择的抗体其针对的抗原决定蔟需要暴露在蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于 IP 实验的抗体提出了很高的要求： a 用于免疫的蛋白抗原其构象需要尽量接近目的蛋白的天然构象或者用于免疫的多肽尽量暴露在目的蛋白的表面。获得接近天然构象的蛋白抗原的途径有很多，主要有天然提取，原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。这其中，就蛋白构象角度而言，天然提取是最佳途径，但这种方法受材料来源限制和纯化方法复杂等多因素影响，一般很少采用。原核表达因为成本低廉，操作方便最为受欢迎，但其受表达环境与大部分蛋白天然存在环境差别巨大，构象失真情况严重，抗原的构象质量有严重问题。大规模瞬时真核表达是近期新兴的表达系统，具有表达环境接近天然，操作方便等诸多优点，是获取具有天然构象蛋白抗原的首选工具。 b 亲和力要比普通的抗体应用要求高得多。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的