从牛奶中分离酪蛋白和乳糖

从牛奶中分离酪蛋白和乳糖一、引言牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙 -磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为20800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点 PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。二、实验材料和试剂脱脂乳或脱脂奶粉。醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7） ，95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。三、实验步骤1. 从牛奶中分离酪蛋白在烧杯中加入2g 脱脂奶粉，再加入40ml40，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml，用 PH 精密试纸检验液体的 PH 值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用） ，剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离35分钟，倾出上层清液， （合并于上一清液中） ，得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml 蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液） ，离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95% 乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml 乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。2. 从牛奶中分离乳糖在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加 CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入12 粒沸石，加热浓缩至3 5ml ，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。3. 乳糖成脎试验取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml 乳糖溶液，1ml 苯肼试剂，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热1015 分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。另外附上：蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的 pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等） ，使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。