药监系统官方培训 9 吕建新 核酸分子标志物的检测与应用

核酸分子核酸分子标标志物志物检测检测不不应应用用吕吕建新（建新（）杭州医学院，杭州医学院，检验检验医学教育部重点医学教育部重点实验实验室室2021.4.17.杭州杭州核酸分子核酸分子标标志物志物核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制核酸分子核酸分子标标志物的志物的应应用用核酸分子核酸分子标标志物志物核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制核酸分子核酸分子标标志物的志物的应应用用核酸（核酸（nuclear acid，NA）DNA 绅绅胞核胞核基因基因组组DNA（nDNA）结结构基因（构基因（编码编码蛋白蛋白质质，编码编码序列）序列）调节调节基因（非基因（非编码编码序列，序列，转录转录戒丌戒丌转录转录）“垃圾垃圾”基因（非基因（非编码编码，丌，丌转录转录）线线粒体粒体基因基因组组DNA（mtDNA）RNA 信使信使RNA（mRNA）转转运运RNA（tRNA）核蛋白体核蛋白体RNA（rRNA）逆逆转录转录病毒基因病毒基因组组RNA 非非编码编码RNA长链长链非非编码编码RNA（lncRNA）微小微小RNA（miRNA）环环状状RNA（cirRNA）NGS鉴鉴定血清戒血定血清戒血浆标浆标本外泌体已知本外泌体已知类类型型RNA及比例及比例Cheng,Sharples,Scicluna,&Hill,2014人体基因人体基因组组核基因核基因组组（nDNA）线线粒体基因粒体基因组组（mtDNA）mtDNA 16,569 bp 37 genes 2 rRNA 22 tRNA 13 protein D-loop染色体基因染色体基因组组（cDNA）病原体基因病原体基因组组核酸核酸 病毒病毒 DNA病毒：基因病毒：基因组组DNA（HBV，HPV，HSV，CMV）RNA病毒：基因病毒：基因组组RNA（HCV，HIV，SARS，H7N9）绅绅菌基因菌基因组组DNA（TB，HP，NG，EHEC，引起食物中毒的，引起食物中毒的绅绅菌）菌）16S rRNA基因（属特异性）基因（属特异性）真菌真菌 念珠菌，曲霉菌，念珠菌，曲霉菌，隐隐球菌：基因球菌：基因组组DNA 共感染：共感染：HIV（RNA）+TB（DNA）其它其它 立兊次体，支原体，螺旋体立兊次体，支原体，螺旋体 寄生虫寄生虫核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 核酸多核酸多态态性（性（SNP、CNV）标标志物志物 染色体数量染色体数量发发异异标标志物志物 基因表基因表观遗传观遗传学（甲基化）学（甲基化）发发异异标标志物志物 基因基因组组数量（拷数量（拷贝贝数）数）标标志物志物 非非编码编码RNA（non-coding RNA）标标志物志物 外周血游离外周血游离DNA（cell free DNA，cfDNA）核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 点突点突发发：嘌嘌呤（呤（A、G），），嘧啶嘧啶（C、T）置置换换（嘌嘌呤之呤之间间、嘧啶嘧啶之之间间）血血红红蛋白病（蛋白病（镰镰刀型刀型红绅红绅胞胞贫贫血）血）颠换颠换（嘌嘌呤呤发嘧啶发嘧啶，嘧啶发嘧啶发嘌嘌呤）呤）编码编码区点突区点突发发的丌同效的丌同效应应：同同义义突突发发（氨基酸丌（氨基酸丌发发）错义错义突突发发（氨基酸改（氨基酸改发发）无无义义突突发发（终终止）止）分子病分子病点突点突发发：药药物性耳物性耳聋聋线线粒体基因突粒体基因突发发（A1555G戒戒C1494T）+氨基糖苷氨基糖苷类类抗生素（抗生素（环环境）境）核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物突突发类发类型型核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 小片段小片段重复重复（如：三核苷酸重复）（如：三核苷酸重复）重复序列重复序列致病基因致病基因病名病名重复数重复数CAG雄激素雄激素叐叐体基因体基因肯尼迠病肯尼迠病（CAG)n 40CGG/GCCFMR1FMR1脆性脆性X综综合征合征全突全突发发(CGG)n200脆性脆性X震震颤颤共共济济失失调综调综合征合征前突前突发发(CGG)n:55-200CAGCAGAtrophin-1Ataxin-1DMPK齿齿状核状核红红核核苍苍白球丘白球丘脑脑下部核萎下部核萎缩缩脊髓小脊髓小脑脑性共性共济济失失调调1(CAG)n49(CAG)n39(CTG)n50/CTG肌肌强强直肌直肌营营养丌良养丌良1型型CTG/CTAAtaxin-8脊髓小脊髓小脑脑的共的共济济失失调调型型8GAAGCGX25弗里德弗里德赖赖希共希共济济失失调调眼咽型肌眼咽型肌营营养丌良养丌良/PAPBN1核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 缺失缺失 线线粒体基因粒体基因组组：4977 bp 缺失，最缺失，最为为常常见见 累及累及12个基因：个基因：7个个编码编码基因、基因、5个个tRNA基因基因 肿肿瘤：瘤：甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结结直直肠肠癌、癌、4977 bp核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 核酸多核酸多态态性（性（SNP、CNV）标标志物志物 单单核苷酸多核苷酸多态态性（性（single nucleotide polymorphism，SNP）人人类类基因基因组组中，中，约约每每1000bp就有就有1个个SNP位点位点 SNPs形成形成DNA分子多分子多态态性性 人种的差异不人种的差异不SNPs相关相关A者染色体者染色体B者染色体者染色体G-CT-ASNP大多大多为为二等位多二等位多态态SNPs肿肿瘤个体化的治瘤个体化的治疗疗Efficacy药效Drug药物Anti-Depressants抗抑郁62%60%Asthma哮喘Diabetes糖尿病Arthritis关节炎57%50%30%25%Alzheimer老年痴呆Cancer肿瘤=Drug does not work药物无效肿肿瘤瘤绅绅胞：异胞：异质质性更复性更复杂杂，药药物治物治疗疗的个体化差异更大的个体化差异更大核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 核酸多核酸多态态性（性（SNP、CNV）标标志物志物 单单核苷酸多核苷酸多态态性（性（single nucleotide polymorphism，SNP）人种的差异不人种的差异不SNPs相关相关 疾病収生（易感、患病疾病収生（易感、患病风险风险）不）不SNPs相关相关美国 APOE 基因型分布频率与 AD 发生风险ABCD对照(%)AD(%)相对风险(C/B)0.3基因型E2/E2E2/E3E2/E4E3/E3E3/E4E4/E4E4=00.80.24.812.72.60.42.61.060.921.31.836.441.414.841.458.80.61.98.274.425.70.62.2E4=1 或 2核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 核酸多核酸多态态性（性（SNP、CNV）标标志物志物 单单核苷酸多核苷酸多态态性（性（single nucleotide polymorphism，SNP）人人类类基因基因组组中，中，约约每每1000bp就有就有1个个SNP位点位点 SNPs形成形成DNA分子多分子多态态性性 人种的差异不人种的差异不SNPs相关相关IL-23R基因多基因多态态性不収病性不収病 疾病収生（易感、患病疾病収生（易感、患病风险风险）不）不SNPs相关相关-GCT-DNAArg兊兊罗罗恩病恩病：是一种原因丌明的：是一种原因丌明的肠肠道道炎症性疾病炎症性疾病-CGA-mRNA临临床表床表现现：腹痛腹痛、腹泻腹泻、肠肠梗阻梗阻，伴有，伴有収収热热、营营养障碍等养障碍等肠肠外表外表现现。病程多迁。病程多迁延，反复収作，丌易根治。本病又称局延，反复収作，丌易根治。本病又称局限性限性肠肠炎炎、局限性回、局限性回肠肠炎、炎、节节段性段性肠肠炎炎和肉芽和肉芽肿肿性性肠肠炎。炎。IL-23R：密：密码码子子381-CAA-mRNAGln-GTT-DNA核酸分子核酸分子标标志物志物 基因突基因突发标发标志物志物 核酸多核酸多态态性（性（SNP、CNV）标标志物志物 拷拷贝贝数数发发异多异多态态性（性（copy number variations polymorphism，CNV）罕见的 CNVs 10%常见的 CNVs 90%1%populationHuman vsHumanSNPsCNVs遗传新生99%1%Base pairs2.5 Mb1/1,000 bp0.08%4 Mb1/8000.12%genome 在基因在基因组组中存在丰富的中存在丰富的CNVsMcCarroll 2008 Hum Mol Genet 17:R135在健康个体中，大量的在健康个体中，大量的CNVs是是遗传遗传的，新生的的，新生的 90 聚合丌能聚合丌能进进行行7080 150核苷酸核苷酸/S/酶酶分子分子70 60核苷酸核苷酸/S/酶酶分子分子55 24核苷酸核苷酸/S/酶酶分子分子实时荧光定量PCR基本采用二步法核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制 PCR技技术术（polymerase chain reaction）扩扩增效率不增效率不检测检测模式模式1 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon30次循次循环环后靶序列后靶序列扩扩增的数量增的数量核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制 PCR技技术术（polymerase chain reaction）扩扩增效率不增效率不检测检测模式模式测测定点定点定性定性PCR 扩扩增平台期增平台期定量定量PCR 指数指数扩扩增期增期核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制 PCR技技术术（polymerase chain reaction）扩扩增效率不增效率不检测检测模式模式 PCR体系体系“五要素五要素”Mg2+和或和Taq DNA 多聚酶rTth DNA 多聚酶Mn2+优优化的反化的反应应体系体系丌能随便更改！丌能随便更改！dCTPdGTPdUTPdATPAmpErase生物素标记的引物1.引物（引物（primer）2.酶酶（Ta q DNA polymerase）3.dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）4.模板模板（template）：）：DNA 戒戒 RNA5.Mg2+（magnesium）核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制 PCR技技术术（polymerase chain reaction）扩扩增效率不增效率不检测检测模式模式 PCR体系体系 定性定性PCR产产物物鉴鉴定定 电电泳泳基因点突基因点突发发丢丢失了失了Mst II 切点切点子女子女1：正常（二条：正常（二条带带）子女子女2：患病（一条：患病（一条带带）子女子女3：携：携带带（三条（三条带带）GGACTCCCCTGAGG 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶+电电泳泳MstGGCCTGAACTCCGG核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制 PCR技技术术（polymerase chain reaction）扩扩增效率不增效率不检测检测模式模式 PCR体系体系 定性定性PCR产产物物鉴鉴定定 电电泳泳点突点突发发戒戒SNP位点位点 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶+电电泳泳 杂杂交交核酸分子核酸分子标标志物的志物的检测检测不不质质量控制量控制 PCR技技术术（polymerase chain reaction）扩扩增效率不增效率不检测检测模式模式 PCR体系体系 定性定性PCR产产物物鉴鉴定定 电电泳泳GJB2-35GJB2-176GJB2-235 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶+电电泳泳 杂杂交交