分散液液微萃取—高效液相色谱法测定食品中农药的含量

1分散液液微萃取高效液相色谱法测定食品中农药的含量张良温 指导教师:翦英红(吉林化工学院 环境与生物工程学院 环境科学 0501 班，吉林 吉林 132022） 摘要：本实验采一种较新的提取分析食品中农药（以阿特拉津为例）残留的方法分散液液微萃取高效液相色谱法。分散液液微萃取条件优化后为：水样体积：6mL；萃取剂：氯苯，30.0L；分散剂：丙酮，1.0mL；离心时间：4min，盐度为 4.5%，pH=5.5。最佳条件下，富集因子(EF)和萃取回收率(ER)分别介于 105.71-129.19 和 45.81% - 58.28%。阿特拉津的最低检出限为1g/L。 水样中阿特拉津在加标浓度为 40、60、80 g/L 的相对回收率分别为 50.72% - 52.95%，45.81% - 52.16%和 51.68% - 58.28%。此种方法测定食品浸出液中阿特拉津方便，快速。关键词：分散液液微萃取；阿特拉津；高效液相色谱法；萃取回收率阿特拉津(atrazine)又名莠去津，化学名：为2-氯4-乙氨基-6一异丙氨基1，3，5-三嗪，系均三氮苯类农药，常温下，阿特拉津的纯品是无色、无臭晶体，分式：C18H14ClN5 ，熔点173175 ，在25 时，蒸汽压为385 Pa ，水中溶解度为 33 mgL。在微酸及微碱介质中稳定，但在高温下，碱和无机盐可将其水解为无除草活性的羟基衍生物 23。阿特拉津是种在世界范围内广泛使用的中等偏低毒性除草剂，曾被认为是生态安全的除草剂，但由于使用量大、残留期长，农田施用后随着地表径流、淋溶、沉降等多种途径进入地表水和地下水，阿特拉津的残留物在世界许多国家和地区的地表水和地下水中已有检出。近来不断有阿特拉津污染事件的报道，已有的研究证明阿特拉津对动物的生殖功能有极大的影响，被世界野生动物基2金会列为环境荷尔蒙(内分泌干扰剂)的可疑物质，有扰乱内分泌的作用，是人类潜在的致癌物。由于阿特拉津被认为是一种最具污染力的农药，目前，包括德国、法国、瑞典在内的欧洲7个圈家禁止使用。分散液液微萃取(DLLME)技术由于其萃取时间短、操作简便，是水样分析的前处理方法之一，它建立于三相溶剂体系。在分散剂的作用下，萃取剂以微小液滴的形式分散在样品溶液中，形成乳浊液，从而对溶液中的分析物进行微萃取。采用离心，可将萃取剂沉积于溶液底部，与溶液分离。本文将分散液液微萃取技术应用于食品水样中痕量阿特拉津的萃取、富集，确定了水样中阿特拉津的最佳DLLME 条件，并最终建立了阿特拉津的分散液液微萃取一高效液相色谱测定方法。1 实验部分11 试剂阿特拉津，丙酮、乙腈、甲醇、氯苯、四氯乙烯、四氯化碳，均为色谱纯。氯化钠( 分析纯 )，氢氧化钠（ 分析纯） ，盐酸（优级纯） 。12 仪器LC一20AT高效液相色谱仪：手动进样器、柱加热器、 PrimoPrimoR多用途台式高速离心机，10 mL戴帽锥形玻璃离心管，50 L微型注射器，200 mL注射器，1mL移液管，2mL试样瓶，0.22 纤维滤膜，吸耳球，1L 大烧杯， 250mL量筒便携式pH计。1.3 水样中阿特拉津的DLLME技术60 mL水样加入锥形玻璃离心管中。10 mL分散剂和30L萃取剂混合均匀后，用200 mL注射器快速注入离心管中。轻轻摇晃后，离心管内的溶液马上乳化、混浊，并最终产生乳浊状溶液。这主要是溶液内形成了萃取剂小液滴，阿特拉津萃取到小液滴中。在4000 rpm转速下离心 10min，萃取剂液滴沉积到离心管底部，形成内含阿特拉津的沉积相。移取10L沉积相，注入HPLC 系统中进行分析。1.4 色谱条件流动相：甲醇：水(8020，vv)，流量10mL/min ；色谱柱：Diamonsil 3C18，柱温 30；检测波长：225nm；进样量：10 L。1.5 实验水样制备购买于早市的黄瓜，西红柿，小白菜，分别取以上三种蔬菜各 250g 分别放置于三个 1L 大烧杯中，加水 500mL 浸泡，分别在10min，30min，60min，120min，取水样进行萃取分析。2 结果与讨论2.1 DLLME萃取条件的优化2.11 萃取剂及体积的确定DLLME技术所需要的萃取剂一般需要满足以下几点要求：(1)有机溶剂的密度大于水。(2) 萃取剂在水中的溶解度要尽可能小。(3)萃取剂对分析物有一定的萃取行为。(4) 萃取剂能与分散剂混溶。(5) 溶剂峰与目标峰在适合的色谱条件下可以完全分离。依据这些原则，本实验考察了氯苯、四氯乙烯、四氯化碳三种萃取剂对阿特拉津的萃取效率(图1)。结果表明：无论是富集倍数，还是萃取回收率，氯苯的萃取效率比其他萃取剂均高。图 1 萃 取 剂 与 EF和 ER的 关 系010203040506070四 氯 乙 烯 四 氯 化 碳 氯 苯萃 取 剂 种 类EF和ER(%)EFER(%)4图 2 萃 取 剂 体 积 优 化01020304050607015 20 25 30 35 40萃 取 剂 体 积 （ L）EF和ER(%)EFER(%)萃取剂体积的大小对萃取效率的影响很大。较大的萃取剂液滴有利于增加灵敏度，为了检验萃取剂体积对阿特拉津萃取的影响，本环节以氯苯作为萃取剂，在离心管中加入 6mL 浓度为 50g/mL 的样品溶液，用 2mL 玻璃注射器分别向水溶液中注入 1.0mL 丙酮和不同体积（15、20、25、30、35、40L ）氯苯的混合溶液，萃取一定时间后，放入离心机中离心十分钟，然后记录离心所得液滴体积并进行色谱分析，结果如图 2 表明：当萃取剂体积为 30L 的时候富集倍数和回收率达到最优。2.12 分散剂及体积的确定分散剂应是既溶于水，又能溶于萃取剂的有机溶剂。本实验考察了丙酮、乙腈、甲醇作为分散剂的情况，实验结果如图 3 所示用丙酮，乙腈 甲醇作为分散剂富集倍数和回收率变化变并不明显，因此，选择低毒和低成本的丙酮做为分散剂。分别在丙酮体积为 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75mL 时进行了实验，得到分散剂体积对萃取效果的影响图(图 4)。可以看出，当分散剂体积为 1 mL 时，阿特拉津萃取效率最高。所以本实验最终选取的分散剂体系为 10mL的丙酮溶液。5图 3 分 散 剂 种 类 与 EF和 ER的 关 系0102030405060708090甲 醇 丙 酮 乙 腈分 散 剂EF和ER(%)EFER（ %）图 4 分 散 剂 体 积 优 化010203040506070800.5 1 1.5 2分 散 剂 体 积 （ mL）EF和ER(%) EFER(%)2.1.3 其他条件的确定主要对溶液的pH、离子强度，萃取时间和离心时间进行了优化，结果分别为图5、6、7、8。结果显示：当溶液的pH值为5.5 时，溶液的NaCI质量分数为4.5时，离心时间为4min时萃取效果均较佳。而萃取时间对阿特拉津的萃取效果影响不明显。所以，本实验最终选取pH为5.5、 4.5NaC1和4 min为最佳的pH6值、离子强度和离心时间。图 5 PH值 优 化01020304050607080901002 3 4 5 6 7 8 9 10 11PH值EF和ER（%）EFER(%)图 6 离 子 强 度 的 优 化01020304050607080900.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5离 子 强 度 NaCl%EF和ER（%）EFER(%)图 7 萃 取 时 间 优 化4150420042504300435044004450450045504600465047000 10 20 30 40 50 60 70萃 取 时 间 （ min）峰面积 封 面 积7图 8 离 心 时 间 优 化0204060801001201402 4 6 8 10 12离 心 时 间 （ min）EF和ER（%）EFER2.2 分析方法考察2.2.1 萃取沉积相标准曲线的绘制为了进行定量分析，通过流动相对标准储备液进行不同梯度的稀释，配制一些列不同浓度的阿特拉津标准溶液用以优化萃取条件进行萃取，然后用HPIC分离检测。用色谱峰面积与对应浓度作萃取标准曲线，求出它们的线性关系和相关系数，经线性回归分析，阿特拉津在20.00-140.00g/L浓度范围内获得良好的线性关系如图（10） 。可知线性方程为y=67.334x+520.01、决定系数R 2 ：09925萃 取 沉 积 相 标 准 曲 线y = 67.334x + 520.01R2 = 0.99570200040006000800010000120000 50 100 150浓 度 （ g/L）峰面积图 9 阿特拉津标准系列萃取沉积相与峰面积的关系曲线82.2.2 加标回收率为考察本实验方法的准确度，对 3 个水样加入不同浓度的标准溶液进行连续测定，所得萃取回收率见表 1 中所示。表 1 阿特拉津加标回收率测量结果水样名称 原始浓度（g/L） 加标浓度（ g/L） 富集倍数 回收率（%）水样 1 ND*406080122.04122.18121.7150.8552.9550.72水样 2 ND406080113.37105.71115.9251.0245.8152.16水样 3 ND406080129.19124.88126.4551.6858.2854.79*ND：低于检出限，未检出。2.2.4 检出限的确定采用稀释倍数法将纯样品的标准溶液稀释为不同梯度，经 HPLC 系统检测，获得不同高度的色谱峰，由检出限的定义分析物的色谱信号三倍于噪声时溶液中分析物的含量（S/N=3）可知，阿特拉津的检出限为 1g/L2.3 实际水样测定将购买自早市的西红柿，黄瓜，小白菜各称取 250g，分别放置于三个 1L 大烧杯中，各加蒸馏水 500mL。浸泡 10min，30min，60min，120min 时取水样，在最优条件下利用分散液液微萃取液相色谱法测量水样中阿特拉津含量。结果如表 2 所示。 93 结论本文采用分散液液微萃取液相色谱法测定食品中阿特拉津的含量，在优化表 2 蔬菜浸泡水样中阿特拉津浓度浸泡时间（min）10 30 60 120西红柿峰面积水样浓度（ g/L）4174.254.272606.330.983468.8543.792609.3531.03白菜峰面积水样浓度（ g/L）2327.926.851930.520.95ND-1656.816.88黄瓜峰面积水样浓度（ g/L）ND-ND-ND-ND-*ND：低于检出限，未检出。实验条件下，得出本方法的线性范围、相关系数、检出限和回收率。实验可知，线性关系良好，阿特拉津在 2-10mg/L 浓度范围内得出标准曲线 y = 585.85 + 740.32，相关系数 R2=0.999，基于信号与噪声比（S/N）为 3，通过稀释倍数法获得阿特拉津的检出限为 1g/L，以 20-140g/L 的阿特拉津水溶液获得萃取标准曲线 y=67.334x+520.01，相关系数 R2=0.9957。水样中阿特拉津在加标浓度为40、60、80 g/L 时的相对回收率分别为 50.72% - 52.95%，45.81% - 52.16%和51.68% - 58.28%本实验方法应用于西红柿，小白菜，黄瓜中阿特拉津的测量。得知西红柿中阿特拉津含量大约为 62.01g/kg ，白菜中的阿特拉津含量大约为37.8g/kg 黄瓜中的阿特拉津低于检出限，未检出。参考文献：101 翦英红，范宁伟，张德分散液液微萃取- 高效液相色谱法测定环境水样中硝基苯 J.天津化工,2011, 25(1):51-53.2 李俊，