包头医学院微生物学与微生物检验实验指导之实验9血凝和血凝抑制实验

实验9 血凝和血凝抑制实验实习目的及意义一、掌握血细胞凝集试验和血细胞凝集抑制试验的原理。二、熟悉流感病毒的分离鉴定程序。三、了解血细胞凝集试验和血细胞凝集抑制试验的方法和结果分析。实验仪器设备及试剂一、材料标本：流感病毒悬液（新分离病毒之羊水或鸡胚尿囊培养液）、流感病人血清、0.5%鸡红细胞悬液、流感病毒型（A、B、C型）及甲型流感病毒亚型（抗A1、抗A2、抗A3）诊断血清、生理盐水。二、器具：试管、试管架、吸管、U型塑料反应板等。实验基本要求一、试验用红细胞为SRBC或人O型红细胞，新鲜红细胞致敏不宜长期保存。实际应用最好用醛化红细胞致敏，致敏后冷冻干燥可长时间保存。二、不同批的致敏血细胞之间重复性差，解决的方法是一次做大量的醛化红细胞备用，减少批次的转换，同时加强质量控制。三、在试验中所用的病毒应灭活，以防传染。四、试验用的血凝板、试管等器材必须十分清洁，否则易造成假阳性。五、试验时一定要有阳性和阴性对照，以保证结果准确可靠。必要时可做凝集抑制试验，以确定凝集的特异性。操作步骤一、血细胞凝集试验：（一）流感病毒的分离鉴定程序2-1 可疑病人早期(前3天)的含漱液、鼻腔洗液、咽喉拭子等 （经青、链霉素处理过夜）鸡胚培养（接种到羊膜腔或尿囊腔） 330C340C 72h 用收获的羊水或尿囊液作血细胞凝集试验 进一步用血细胞凝集抑制试验 盲传两代鸡胚仍为阴性或补体结合试验定型 时报告阴性 图2-1流感病毒的分离鉴定程序 （二）原理:流感病毒表面有一种糖蛋白的血凝素(HA),能与人及一些哺乳动物的红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞凝集，其不属于抗原抗体的特异性凝集。据此原理而建立的血凝试验可用来测试病毒体的存在，也可用于病毒的鉴定。（三）方法1、取10只清洗干净的小试管，按表2-1所示在各管加入生理盐水，其中第1管为0.9ml，其它各管均加0.25ml。2、取新分离的流感病毒悬液0.1ml，加入第1管中作1：10的稀释，混匀后吸取0.5ml弃之，再吸取0.25ml(1:10)稀释液加至第2管混匀，即为1:20的稀释，从第2管取出0.25ml加至第3管混匀，依次作倍比稀释至第9管取出0.25ml弃之。这样，各管的液体量均为0.25ml，从第1到第9管的稀释度为1:10，1:20，1:401:2560，第10管为生理盐水对照。3、倍比稀释后，每管加入0.5%的鸡红细胞悬液0.25ml，轻轻摇匀后置室温，45min后观察结果。表6-8流感病毒血细胞凝集试验的加样顺序表(单位:ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 生理盐水 0.9 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 (弃0.5) (弃0.25)病毒稀释度 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照 0.5%鸡红细胞 各管加0.25ml 摇匀后，室温静置45min结果举例 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ + + - - 结果分析和报告1、结果的观察和判断标准：观察结果是一定要轻拿轻放，各管中红细胞凝集程度不同，用-、+、2+、3+、4+表示，以出现“2+”的最高病毒稀释液作为血凝效价（滴度），即1个血凝单位。4+：一层红细胞全部均匀铺于管底，无红细胞沉积。3+：大部分红细胞凝集呈薄层均匀平铺底部，但有少数细胞沉于管底中心形成一个小红点。2+：约有半数红细胞凝集在管底并铺成一个环状，四周有小凝集块。+ ：多数红细胞在管底沉积成圆点，少数凝集的红细胞散在周围形成小凝快。- ：无红细胞凝集，红细胞沉于管底形成边缘整齐光滑的致密圆点。2、结果报告 按举例的结果，流感病毒的血凝效价（滴度）为1:160，即病毒稀释至1:160时，每0.25ml病毒稀释液中含1个血凝单位，配制成含有4个血凝单位时，病毒液应稀释成1：40。如果血凝试验为阳性，则做血凝抑制试验进行进一步的证实，并可确定流感病毒的型和亚型。二、血细胞凝集抑制试验（一）原理：流感病毒悬液中加入特异的抗血清后，再加入人“O”型、鸡或豚鼠的红细胞就不会再发生血凝现象，即为血凝抑制。在该试验中若病毒的抗血清是已知的，则可鉴定该病毒的型与亚型，此为定性试验；相反，若病毒是已知的，则可测定患者血清中有无相应的抗体，此为定量试验。操作时应先将病人血清进行处理，目的是除去血清中非特异性抑制物或凝集素，并要求取患病初期和恢复期的双份血清作两次试验，只有恢复期血清抗体效价比初期高4倍以上，才有诊断意义。（二）定性试验1、先在U型反应板上选择7个孔并排好序号。2、4个血凝单位的流感病毒悬液分别加入上述7孔内，每孔两滴（100微升）。然后在1、2孔上分别加入流感病毒A型、B型的诊断血清，3、4、5孔分别加入抗A1、抗A2、抗A3的诊断血清，6孔加鸡血清、7孔加生理盐水，以上各孔加量均为2滴，加完后轻轻晃动，使所加试剂充分混匀，放置5min后再进行下面操作。3、上述7孔中分别加入0.5%鸡红细胞2滴轻轻摇动反应板使各孔内容物混匀，室温静置50min左右后观察结果。结果分析和报告：凡出现明显血凝现象的反应孔，即全部或大部分红细胞凝集平铺孔底，无红细胞沉积或有少量红细胞沉积于中心，为血凝抑制试验阴性。而未出现血凝现象或血凝现象不明显的试验孔，即血细胞沉积于孔底形成边缘整齐光滑小圆点者，周围可有少量凝集的红细胞散在，就可判断新分离病毒与该孔所用诊断血清的型或亚型相一致。（三）定量试验 1、先将患者血清用霍乱液处理以除去血清中非特异性抑制物。2、再将血清作倍比稀释，取洁净试管10只，编号后排于试管架上，其中第1至第7管为试验管，第8管为病毒对照，第9管为血清对照，第10管为鸡红细胞对照。3、在10只试管中分别0.25ml生理盐水。4、取经过处理的患者血清1：5的稀释液0.25ml,加入第1管中形成1:10的稀释液，混匀后取0.25ml加至第2管，照此依次作倍比稀释，至第7管为止。5、在第1至第8管中分别加入流感病毒悬液0.25ml（每0.25ml含4个血凝单位），9、10管为血清对照管和红细胞对照管，所以不加流感病毒悬液（混匀后置370C2h作用后，效果更佳）。6、最后在每管中加入0.5%鸡红细胞0.5ml，轻轻摇动后放置室温，45min后观察结果。（表2-2）。结果分析和报告观察血凝的判断标准与血细胞凝集试验相同。但不同的是，本试验是以不出现血凝现象为阳性，凡呈现完全凝集抑制（血细胞不凝集）的试管中，其血清的最高稀释度作为血凝抑制效价。临床意义 间接血凝试验在临床检验中应用广泛，主要用于以下几个方面。1、 用于临床诊断。2、检测抗病原生物抗体，也可用于检测自身抗体，如抗核抗体、类风湿因子等。3、用于病毒的分型鉴定。4、反向间接血凝试验常用于检测血中乙肝表面抗原和甲胎蛋白等。表2-2 流感病毒血细胞凝集抑制试验(单位:ml) 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 病毒 血清 红细胞 对照 对照 对 照 生理盐水 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.2515病 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0 0 0 人血清病人血清 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 稀释度4单位病 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0 0毒抗原5%鸡红细胞0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5思考题1、 细胞凝集抑制试验的原理是什么？2、 细胞凝集试验和血细胞凝集抑制试验的注意事项是什么？