《谷氨酸发酵控制》PPT课件

4 谷氨酸发酵过程控制谷氨酸发酵过程控制 一般认为无论是野生株还是突变株，在增殖旺盛、进行正常代谢的微生物培养液中不存在特定的生物合成代谢中间产物大量地分泌累积的现象。因此，为了累积特定的氨基酸，必须用某些方法使微生物的代谢调节异常化。 谷氨酸产生菌之所以能够大量积累谷氨酸，首先是菌体代谢调节异常。这种代谢异常的菌种对环境条件是敏感的。谷氨酸酸发酵是建立在容易变化的代谢平衡上，是受多种条件支配的。在不同的环境条件下，可生长大量菌体或者得到不同的代谢产物。 表4-1 由葡萄糖生产谷氨酸时谷氨酸与菌体的生成率 表4-1中生产培养时添加3g/L生物素，增殖培养时添加200300g/L生物素。结果在生产培养时，葡萄糖多半是用于合成谷氨酸。与此相反，在增殖培养时近半量的葡萄糖用于合成菌体，而几乎不生成谷氨酸。生产培养的菌体形态与增殖培养的菌体形态存在显著差异，生产型菌体伸长呈膨润状态，边缘不完整。而增殖型菌体呈类球形或短杆状，且这两种细胞的表层结构和机能有很大差别。表表4-2 4-2 谷氨酸产生菌因环境条件改变而发生发酵转换谷氨酸产生菌因环境条件改变而发生发酵转换 表4-2表示在不同环境条件下生成不同的代谢产物。在最适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌可将60%以上的葡萄糖转化为谷氨酸，而只有极少量的副产物。与此相反，如果培养条件不适宜，几乎不产生谷氨酸，而得到大量菌体或者由谷氨酸发酵转换为积累乳酸、琥珀酸、-酮戊二酸、缬氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰谷氨酰胺等，这种现象称为“发酵转换”。 菌种的性能越高，使其表达接近它应有的生产潜力所必须的条件就越难满足，对环境条件的波动更为敏感，谷氨酸发酵正是如此。可见环境条件的控制对谷氨酸发酵的产酸率、糖酸转化率等的高低是非常重要的。 目前国外较先进的发酵罐都可以用电子计算机进行参数(温度、罐压、搅拌速度、空气流量、pH、溶解氧、消泡、氧化还原电位、尾气等)测量和控制。但是一些对控制发酵过程至关重要的参数，如底物、产物、中间产物、细胞浓度、发酵液的黏度、气液界面面积等，却还不能顺利地进行联机(在线)测量和控制。 这主要是由于缺乏可以发挥电子计算机潜在全部优点的、适合自动监控发酵过程中某些参数的传感器。随着生物传感器、自动化分析方法以及电子计算机与生物技术之间接口技术的发展，将扩大计算机技术在微生物工程方面的应用范围，使发酵生产过程实现高度自动化。 应用电子计算机控制和管理发酵，使发酵工艺最佳化。用计算机可借在线分析做到间接测量，进而达到在线控制。由于计算机的计算速度，它们可以维持发酵的程序控制，提供底物和细胞浓度的瞬间读数。例如通过连续测定排气中O2和CO2浓度，进行氧平衡，计算出耗氧速率和呼吸商，从而获得细胞浓度，能准确地确定添加青霉素的时间。 采用计算机控制流加糖，减少糖浓度波动，提高转化率。目前借助电子计算机控制的参数有：温度、压力、空气流量、pH、溶解氧、消泡、补料、排气中O2、排气中CO2、溶解氧系数、搅拌转速等。4.1 发酵培养基发酵培养基 与种子培养基不同，发酵培养基不仅是供给菌体生长繁殖所需要的营养和能源，而且是构成谷氨酸的碳架来源，要积累大量谷氨酸，就要有足够量的碳源和氮源，其用量大大地高于种子培养基，对于菌体繁殖所必需的营养因子生物素却要控制其用量。 与其它发酵工业一样，谷氨酸发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等。发酵工业原料主要是指发酵培养基中用量比较大的成分。这些原料的选择既要考虑到菌体生长繁殖的营养要求，更重要的要考虑到有利于大量积累谷氨酸，还要注意到原料来源丰富、价格便宜、发酵周期短和对产物提取无妨碍等。4.1.1 碳源 碳源是供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及合成谷氨酸的碳架的来源。谷氨酸产生菌是异养微生物，只能从有机化合物中取得碳素的营养，并以分解氧化有机化合物产生的能量供给细胞中合成反应所需要的能量。 通常用作碳源的物质主要是糖类、脂肪、某些有机酸、某些醇类和烃类。 由于各种微生物所具有的酶系不同，所能利用的碳源往往是不同的。目前所发现的谷氨酸产生菌均不能直接利用淀粉，只有利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等单糖或双糖，有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃等。由于国内绝大多数味精厂采用的碳源为淀粉水解糖，因此这里主要介绍淀粉水解糖作业碳源的发酵。 培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有很大影响。在一定范围内，谷氨酸产酸率随糖浓度增加而增加，但当糖浓度过高时，由于渗透压增大，对菌体生长和发酵均不利，当工艺条件配合不当时，糖酸转化率相当低。同时培养基浓度大，氧溶解的阻力也增大，影响供氧效率。 为了降低培养基中糖浓度而又提高产酸水平，目前国内普遍采用低浓度初糖的流加糖发酵工艺。初糖812%，流加糖后总糖20%左右，产酸率可达11%以上，糖酸转化率达55%以上。 淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵的影响很大。如果淀粉水解不完全，如有糊精存在，不仅造成原料浪费，而且还会使发酵过程产生很多泡沫，影响发酵的正常进行。淀粉原料不同，液化、糖化工艺条件不同，使水解糖中生物素含量也不同，影响谷氨酸培养基中生物素含量的控制。 由于双酶法（高温淀粉酶液化、糖化酶水解）对原料中生物素等营养因子破坏很少，因此采用双酶法制糖时，如果采用生物素亚适量工艺进行谷氨酸发酵，尽量采用精制淀粉。4.1.2 氮源 氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成谷氨酸氨基的来源。同时，在发酵过程中一部分氨用于调节发酵液pH，形成谷氨酸铵。因此，谷氨酸发酵需要的氮源比一般的发酵工业要高，一般发酵工业碳氮比为100: 0.22.0，而谷氨酸发酵的碳氮比为100: 1530。 当培养基中碳氮比在100: 11以上才开始积累谷氨酸。在谷氨酸发酵中，用于合成菌体的氮仅占总耗用氮的38%，而3080%用于合成谷氨酸。在实际生产中，由于一部分氨用于调节pH，一部分随空气逸出，造成实际用量较大，当培养基中糖浓度为14%时碳氮比为100：32.8。 碳氮比对谷氨酸发酵影响很大，在发酵的不同阶段，控制碳氮比以促进以菌体生长为主的阶段向产酸阶段转化。在长菌阶段，如NH4+过量也会抑制菌体生长；在产酸阶段，如NH4+不足，-酮戊二酸不能还原并氨基化，几乎不积累谷氨酸，而积累-酮戊二酸。 氮源有无机氮和有机氮之分。无机氮如尿素、液氨、氨水、碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等。菌体利用无机氮源比较迅速，而利用有机氮较缓慢。铵盐、尿素和液氨等比硝基氮优越，因为硝基氮需先经过还原后才能被利用。一般要根据菌种和发酵特点合理地选择氮源。 采用不同的氮源其添加方法不同，如液氨、尿素等可采取流加方法。液氨作用快，对pH影响大，应采取连续流加；尿素加入后先经过谷氨酸产生菌中脲酶水解成氨后再利用，因此会滞后，一般根据菌种的脲酶活力分36次分批流加。 用硫酸铵等生理酸性盐为氮源时，由于NH4+被利用而残留的SO42-等酸根，使pH下降，因此在培养基中需要加入CaCO3以自动中和，维持pH相对稳定；但是添加大量CaCO3容易导致染菌，且Ca2+对产物提取有影响，因此一般生产上不采用此法。 目前，考虑到生产成本、操作方便等因素，谷氨酸发酵已全部采用液氨作为无机氮源。由于液氨作用快，对pH影响大，故生产上都采用连续流加方法。 有机氮源主要是蛋白质、蛋白胨和氨基酸等。谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆、麸皮水解液、米糠水解液、豆饼水解液和糖蜜等。有机氮，尤其是氨基酸丰富则有利于长菌。谷氨酸发酵时对有机氮的需要量不大。 4.1.3 无机盐 无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。其功能如下： 构成菌体成分； 作为酶的组成部分； 酶的激活剂或抑制剂； 调节培养基的渗透压； 调节pH 和氧化还原电位等。 一般微生物所需要的无机盐为磷酸盐、硫酸盐、氯化物和含钾、钠、镁和铁的化合物。还需要一些微量元素，如锰、铜、锌、钴、钼、碘和溴等。微生物对无机盐的需要量很少，但对菌体的生长和代谢产物的产生影响很大。 磷酸盐 磷是一些蛋白质和核酸的组成分。腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)、NADPH等是重要的能量传递者，参与一系列的代谢反应。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。 微生物对磷的需要量一般为 0.0050.01 mol/L。 工业生产上常用的磷酸盐为KH2PO4、K2HPO43H2O、Na2HPO412H2O和NaH2PO42H2O等，也可用磷酸。 当采用K2HPO43H2O时，添加量一般为0.1%。 考虑到生产成本，一般采用 Na2HPO412H2O或NaH2PO42H2O ，但另外要添加KCl。 磷酸盐对谷氨酸发酵影响很大。当磷酸盐偏高时，菌体代谢转向合成缬氨酸；但如磷酸盐过低，菌体生长也不好，造成延长发酵时间，影响谷氨酸的合成。 硫酸镁 Mg2+许多重要酶(如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。如果Mg2+含量太少，就会影响其底物的氧化。一般革兰氏阳性菌对Mg2+的最低要求为25mg/L；革兰氏阴性菌为45mg/L。 MgSO47H2O中含Mg2+ 9.87%，发酵培养基中添加0.5g/L MgSO47H2O时，Mg2+浓度约为50mg/L。 硫存在于细胞蛋白质中，是含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）的组成部分；也是一些酶的活性基团重要组成部分。由于培养基中硫已在硫酸镁中供给，因此不必另外添加。 钾盐 钾一般不参与细胞结构物质的组成，但它是许多酶（EMP途径和TCA循环中一系列酶）的激活剂。谷氨酸生物合成时所需要的钾盐比菌体生长需要量高。菌体生长时需要钾盐0.1 g/L(以K2SO4计，以下同)，谷氨酸生成时需钾盐为0.21.0 g/L。 钾对谷氨酸发酵影响明显，钾盐少长菌体；钾盐足够时产谷氨酸。当培养基中配用1.0 g/L K2HPO43H2O时，其钾浓度约为0.38g/L。如果采用Na2HPO412H2O时，应配用0.30.6 g/L KCl，此时钾浓度为0.350.70g/L。 微量元素微生物需要量十分微小但又不可完全没有的元素称为微量元素。 Mn2+是某些酶的激活剂，羧化反应必需Mn2+ ，如谷氨酸生物合成途径中，草酰琥珀酸脱羧生成-酮戊二酸是在Mn2+存在下完成的。一般培养基添加0.01g/L MnSO44H2O。 Fe2+是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的组成部分，又是若干酶的激活剂，一般培养基添加0.01g/L FeSO44H2O。 一般作为碳氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另外添加。而某些重金属离子，特别是汞和铜等离子，具有明显的毒性，抑制菌体生长和谷氨酸合成，因此，必须避免有害离子混入到培养基中。 生长因子 从广义来说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、碱基（嘌呤、嘧啶）、维生素等均称为生长因子。 生长因子不是所有微生物都必需的，它只对于那些自身不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。 目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素（VH）缺陷型，以生物素为生长因子。有些菌株还以硫胺素（VB1）为生长因子，有些变异株为油酸缺陷型还以油酸作为生长因子。 生物素是B族维生素的一种，又称维生素H或辅酶R，其结构式如下： 生物素作为酶的组成成分，参与机体的三大营养物质糖、脂肪和蛋白质的代谢，是动物机体不可缺乏的重要营养物质之一。 在谷氨酸发酵中，生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的合成，从而影响谷氨酸通透性，同时也影响菌体的代谢途径，即代谢产物的生成。生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累都有影响。 谷氨酸产生菌大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长所需的生物素浓度要低得多，即为菌体生长所需的“亚适量”。谷氨酸发酵最适生物素浓度随菌种不同、碳源种类和碳源浓度以及供氧条件不同而不同，一般为5g/L左右。 如果生物素过量，菌体大量繁殖而不产或少产谷氨酸，而转产乳酸或琥珀酸。在生产中表现为长菌快，耗氧快，pH低，液氨消耗多。若生物素不足，菌体生长不好，谷氨酸产量也低，表现为长菌慢，耗糖慢，发酵周期长。当供氧不足，生物素过量，发酵向乳酸发酵转换。供氧充足，生物素过量，糖代谢倾向于完全氧化生成CO2和水。 菌体从培养液中摄取生