PCR技术81626

农业生物学实验教学中心目 录PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例农业生物学实验教学中心 多聚酶链式反应（PCRPCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction) KaryKary B. Mullis B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制的体内复制的DNADNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。农业生物学实验教学中心体内DNA的复制体系DNADNA聚合酶聚合酶（I II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类SSBSSB 引物引物dNTPdNTP Mg Mg2+2+5 5 33农业生物学实验教学中心MullisMullis的的PCRPCR构思构思引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermusthermus aquaticusaquaticus) )酶酶活性活性(%)(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。农业生物学实验教学中心PCR反应循环727294945555PCRPCR循环循环变性变性退火退火延伸延伸农业生物学实验教学中心 PCRPCR的指数扩增（的指数扩增（2 2n n）引物引物延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火农业生物学实验教学中心TaqTaqP1P1P2P2PCRPCR反应体系反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1 P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+农业生物学实验教学中心1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1）模板）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCRPCR反应条件反应条件农业生物学实验教学中心（2 2）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3 3）TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。农业生物学实验教学中心（4 4）dNTPdNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。农业生物学实验教学中心（5 5） Mg2+Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。农业生物学实验教学中心2 2）循环参数）循环参数(1)(1)变性变性 (2)(2) 使双链DNA解链为单链 94， 20-30秒(2) (2) 退火退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。农业生物学实验教学中心（3 3）延伸）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4 4）循环次数）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加农业生物学实验教学中心PCRPCR技术的特点技术的特点1 1 ）高度的灵敏性）高度的灵敏性3030轮循环轮循环扩增量达230个拷贝PCR产物每轮循环增加一倍农业生物学实验教学中心2 2）特异性）特异性引物引物引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反 应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。农业生物学实验教学中心 PCRPCR引物设计：引物设计：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4（G+C）2（A+T），在Oligo 软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method)。 6. ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端?G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 农业生物学实验教学中心3 3）操作简便易行）操作简便易行 利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。 农业生物学实验教学中心1 1）不对称）不对称PCRPCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究 PCRPCR的类型的类型 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物农业生物学实验教学中心2)2)反向反向PCR (reverse PCR) PCR (reverse PCR) 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列农业生物学实验教学中心已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶农业生物学实验教学中心3 3）多重）多重PCRPCR（复合复合PCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。农业生物学实验教学中心电电泳泳引物引物12341234农业生物学实验教学中心4 4）LP-PCRLP-PCR（LabelledLabelled primers) primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分农业生物学实验教学中心标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物农业生物学实验教学中心5 5）锚定）锚定PCRPCR（anchored PCR, A-PCRanchored PCR, A-PCR） 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增农业生物学实验教学中心cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG55CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC农业生物学实验教学中心6 6）PCRPCR固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引化引物物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相相介质介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作农业生物学实验教学中心7 7）原位）原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。农业生物学实验教学中心操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达农业生物学实验教学中心8 8）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增农业生物学实验教学中心9) 9) 荧光定量荧光定量 PCRPCR（real-time PCR)real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 AmplifluorAmplifluor ( (IntergenIntergen) )农业生物学实验教学中心5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 农业生物学实验教学中心 实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪农业生物学实验教学中心PCR示例一、实验目的学习PCR分析的原理与技术。农业生物学实验教学中心1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体PMG18-T 质粒DNA2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2二、实验材料、仪器和试剂农业生物学实验教学中心1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水补充至 25.0 L三、操作步骤农业生物学实验教学中心2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水补充至 25.0 L三、操作步骤农业生物学实验教学中心农业生物学实验教学中心3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。三、操作步骤琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳农业生物学实验教学中心