1, 6-二磷酸果糖的国内研制概况
中国药科大学学报Journal of China PharmaceuticalUniversity 2000, 31(2):139-1421,6-二磷酸果糖的国内研制概况范贵增 1,王青牡 2(1 江西省科学院微生物研究所,江西南昌 330029;2 江西省儿童医院药剂科江西南昌330006)摘 要: 综述了国内使用游离酵母细胞法和固定化酵母细胞法生产 1,6-二磷酸果糖的概况。关键词:1, 6-二磷酸果糖;磷酸化反应;游离酵母细胞;固定化酵母细胞本世纪初,Harden 和 Y oung1在研究糖代谢机理时就完成了 1,6-二磷酸果糖( fructose-1, 6-diphosphate, FDP)的分离和鉴定。1942 年,美国 Neuberg2等利用新鲜酵母细胞使葡萄糖磷酸化制备了 FDP。近几年的多项研究表明,FDP 对人体代谢调节具有多种功能,因此在医药、食品、保健品和化妆品等行业的应用日益广泛,特别是在医学上的应用,引起了国内外学者的高度重视,一时成为研究的热点之一。1 细胞膜通透性改变FDP 制备的方法有游离细胞和固定化细胞法,两法都必须改变细胞膜的通透性才能使FDP 透过细胞膜并积累于反应介质中。甲苯、氯仿、乙醚。Tri-tion X-100 等有机溶剂可以改变细胞膜的通透性,其中应用最多的为甲苯,用量为反应总体积的 3%6 %3。由于甲苯的挥发性较大,在发酵及后处理工段均会引起工场的环境污染。于明安 4等在国内首次报道用 0.2%溴化十六烷基铰(CTAB)改变酵母细胞膜的通透性,解决了污染问题,取得了良好的效果。目前我国已有多个厂家采用这一技术。2 游离酵母细胞生产 FDPNeuberg2和 Leisola5等采用游离酵母细胞法,以糖、磷酸盐为底物,经酶促磷酸化反应,成功地制备 FDP。此法经多次改进后,一直沿用至今,是国内外工业生产 FDP 的常用方法。华南理工大学王克勤 6等应用游离酵母细胞法,采用啤酒厂废弃酵母进行中试生产,其投料糖粗品转化率 15%、纯品回收率 75%、纯品产率 11.5%。生产的 FDP 纯度大于96%,外观洁白,经游离磷酸、己糖单磷酸、钙离子等杂质检测,质量优于意大利进口产品标准。于明安等 1989 年完成了游离酵母酶促磷酸化反应的最适条件研究,反应时间缩短至 4 h, FDP 浓度提高到 75g/L,1993 年进行药厂中试,获得了满意的结果。笔者 7 于 1995年起开始研究 FDP 的制备,在工作中体会到,游离细胞产 FDP 的浓度,除取决于有机溶中国药科大学学报Journal of China PharmaceuticalUniversity 2000, 31(2):139-142剂改变细胞膜的通透性外,酵母细胞的培养时间和贮存条件均有较大的影响。将酵母洗净且贮存于 400C 可最大限度保存细胞产 FDP 的酶系活力。如此保存的酵母细胞经酶促磷酸化反应 4h,可使 FDP 浓度达 72 g/L。3 固定化酵母细胞生产 FDPFDP 是己糖代谢的一种胞内中间产物,改变细胞膜的通透性,由糖酵解循环中释放出来的 FDP 才可自由地透过细胞膜并积累于反应介质中。但是,细胞透性改变的同时也带来了酶的流失现象,改变透性的细胞很难保持最旺盛的磷酸化能力,不能重复使用。要重复使用酵母细胞并连续化生产 FDP,就必须采用固定化酵母细胞的方法。Bisso 8等成功地使用交联剂戊二醛交联改变透性的酵母细胞防止酶的泄漏,制成固定化的多酶体系,在中空纤维反应器中,连续化生产 FPP,产率为 240 m g/h;杜振宁 9等用卡拉胶包埋酵母细胞,外加代谢调节因子,在连续反应器内,每克湿菌体每天可产 FDP450 mg,连续使用 200 h, FDP 产率基本不变。孙志浩 等用卡拉胶、明胶、几丁质、二酷酸纤维包埋及戊二醛交联的方法制备固定化酵母细胞,研究出固定化酵母细胞的磷酸化条件为:温度370C。pH 6.5,糖浓度 1.0mo1/L ,磷浓度 0.81.0 mo1/L。卡拉胶法、聚乙烯亚胺法和二醋酸纤维法的转化液中 1,6-二磷酸果糖酸( FDPH4)的含量最高分别为 50.0、59.5 和 60.5 g/L。王 11,12 等用戊二醛交联酵母细胞,再包埋于聚乙烯醇中,制成含糖酵解部分酶系的固定化多酶体系,选用氯丙嗪作为醛缩酶的抑制剂,再偶联上 ATP 再生系统,连续生产 FDP,产量可维持在 18.5 g/L, 1996 年成功地完成了中试研究,固定化酶表现活力大于 550 m gFDP/( dg 湿细胞) ,底物转化率大于 15%。利用酵母细胞生产 FDP 是目前制药工业中较新技术。1992 年国产 FDP 问市,但进口产品仍占据了部分市场。1998- 1999 年间 FDP 已较大幅度降价,且进口量明显减少。FDP 是生化药物,属高附加值产品。由于 FDP 具有多种特殊功能,其开发与应用的潜力巨大。参考文献:1 Harden A, Young W.Proc Roy Soc, 1908, 80: 2092 Neuberg C, Lustig H. J Am Chem Soc, 1942, 64: 27223 中国专利 93110528.5. CN 1994: 1089654A; CA 1995, 122:54182S)4 于明安,徐昌喜,余惠媛生物医学工程杂志,1995, 12(2):106中国药科大学学报Journal of China PharmaceuticalUniversity 2000, 31(2):139-1425 Leisola M,Linko M. Acta Chem Scand, 1974, 28: 5556 王克勤,姚汝华,郭勇中国生化药物杂志,1993, 66 (3): 147 范贵增,熊占,熊国真,等江西科学,1998, 16(4 ):1558Bisso GM, MelelliF. ProcBiochem,1986, 21(4):1139杜振宁,吴梧桐药学进展,1992, 16(3): 14510孙志浩,吴燕,王蕾,等工业微生物,1996, 26(2 ): 711王,张宏兴,王丁刚,等药物生物技术,1995, 2( 4):5012王,王丁刚,吴梧桐,等药物生物技术,1996, 3( 1):40A Brief Survey of Fructose-1,6-diphosphate Production in ChinaFAN Gui-Zeng',WANG Q ing-M uz( 1. Institute of Microbiology, Academy of Sciences, JiangxiNanchang 330029;2. The Medicament Section, Children Hospital, J iangxi, N anchang 330006)ABSTRACT: The current progress in production of fructose-1,6-diphosphate was reviewed. The methods of free and 加 m obilized yeast cells were compared and discussed.Key Words: fructose-1,6-diphosphate; phosphorylation; free yeast cells; imm obilized yeast cells