分子遗传课件130728 第四章 复制

第四章 复制 Chapter 4 Replication欧阳红生动物生物技术系吉林大学动物科学学院Email:Tel:0431-87836175Chapter 4 ReplicationCopyright2013byOuyangHongsheng.Allrightsreserved.第四章第四章 复制复制第四章 复制 Chapter 4 Replication主要内容：复制概况复制体系复制的起始延伸过程复制终止其他原核生物的复制体系其他形式的复制真核生物的复制过程第四章 复制 Chapter 4 ReplicationDNA复制replication是指以DNA分子为模板合成DNA的过程，遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代。第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication1.概念DNA复制过程中，双链DNA分子都作为模板，合成各自的互补链，两条新合成的子链分别与各自模板链一起形成两个子代DNA分子，每个子代DNA分子中都有一条链是母链，一条链是新合成的子链，DNA的这种合成方式就是半保留复制。第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication1.概念DNA复制过程中，双链DNA分子都作为模板，合成各自的互补链，两条新合成的子链分别与各自模板链一起形成两个子代DNA分子，每个子代DNA分子中都有一条链是母链，一条链是新合成的子链，DNA的这种合成方式就是半保留复制。2.1958年,Meselson和Stahl设计的证明半保留复制的实验。第四章 复制 Chapter 4 Replication首先让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长，经过多代培养所有的DNA分子都被标记上15N。15NDNA的密度比普通14NDNA的密度大，通过氯化铯密度梯度离心，两种DNA形成位置不同的区带。将有15N标记的大肠杆菌转移到普通的培养基(含14N的氮源)中培养，一代后，所有DNA的密度都介于15NDNA和14NDNA之间，即形成15N14N杂合分子。两代后，14N分子和14N15N杂合分子等量出现。若继续培养，14NDNA子增多。这说明在DNA分子复制时，原来的DNA分子被分为两个亚单位，分别构成子代分子的一半。第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication1.概念2.1958年,Meselson和Stahl设计的证明半保留复制的实验。3.半保留复制是双链DNA普遍采用的复制机制。即使单链DNA分子，在其复制过程中通常先形成双链的复制形式。第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication二、复制起点、方向和方式1.复制起点DNA复制开始的位置，原核生物只有一个复制起点，真核生物有多个复制起点，形成多个复制单位。每一个复制单位都称为复制子replicon,复制子是基因组中能独立进行复制的单位。第四章 复制 Chapter 4 Replication表4-1 不同生物的复制子 第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication二、复制起点、方向和方式1.复制起点DNA复制开始的位置，原核生物只有一个复制起点，真核生物有多个复制起点，形成多个复制单位。每一个复制单位都称为复制子replicon,复制子是基因组中能独立进行复制的单位。2.复制起点是一个顺式作用位点，只影响其所在的区域的DNA。复制起点与终点之间的序列作为复制子的一部分参与复制。第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication二、复制起点、方向和方式1.复制起点DNA复制开始的位置，原核生物只有一个复制起点，真核生物有多个复制起点，形成多个复制单位。每一个复制单位都称为复制子replicon,复制子是基因组中能独立进行复制的单位。2.复制起点是一个顺式作用位点，只影响其所在的区域的DNA。复制起点与终点之间的序列作为复制子的一部分参与复制。3.复制叉复制正在发生的位点叫做复制叉。第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication二、复制起点、方向和方式1.复制起点2.复制起点是一个顺式作用位点，只影响其所在的区域的DNA。复制起点与终点之间的序列作为复制子的一部分参与复制。3.复制叉复制正在发生的位点叫做复制叉。复制叉从起点开始沿着DNA移动。4.复制可单向进行，也可双向进行，单向复制时，有一个复制叉从起点开始沿着DNA移动。双向复制时，两个复制叉沿着相反的方向远离起点移动。第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication二、复制起点、方向和方式1.复制起点2.复制起点是一个顺式作用位点3.复制叉4.复制可单向进行，也可双向进行，单向复制时，有一个复制叉从起点开始沿着DNA移动。双向复制时，两个复制叉沿着相反的方向远离起点移动。5.复制叉在电镜下形如眼睛，称为复制眼，环状DNA形成-结构。第四章 复制 Chapter 4 Replication球状DNA的复制眼形成结构第四章 复制 Chapter 4 Replication二、复制起点、方向和方式5.复制叉在电镜下形如眼睛，称为复制眼，环状DNA形成-结构。6.大肠杆菌的复制起始点含245bp序列。大肠杆菌的基因组从oriC位点开始双向复制，含有oriC的人工质粒可在细菌中复制并存活下来，通过不断缩小人工质粒中oriC片段的大小，最终确定开始复制需要245bp的区域第四章 复制 Chapter 4 Replication二、复制起点、方向和方式6.大肠杆菌的复制起始点含245bp序列。大肠杆菌的基因组从oriC位点开始双向复制，含有oriC的人工质粒可在细菌中复制并存活下来，通过不断缩小人工质粒中oriC片段的大小，最终确定开始复制需要245bp的区域7.大肠杆菌复制终止序列所含一段短的（22bp)区域，可在体外终止复制。大肠杆菌的复制终止区100kb内，两条链上各有两个终止区域（terE、D、A和terF、C、B)，每个终点只对特定方向的复制叉有终止作用。终止需要tus基因的产物，识别ter共有序列并阻止复制叉行动。第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication二、复制起点、方向和方式三、DNA聚合酶与DNA聚合反应复制是由DNA聚合酶负责完成的。在适量DNA和镁离子存在下，DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA的3OH末端加入一个核苷酸使DNA链由5向3方向延长，同时释放无机焦磷酸。合成的DNA与天然的DNA有相同的化学结构和物理化学性质。DNA聚合反应可表示如下:Poly(核苷酸)n-3OH+dNTPPoly(核苷酸)n+1-3OH+PPi第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication二、复制起点、方向和方式三、DNA聚合酶与DNA聚合反应四、复制的基本过程第四章 复制 Chapter 4 Replication四、复制的基本过程DNA的复制包括起始、延伸、终止三个步骤。复制调控发生在起始阶段复制子增殖依赖于起始过程中原点处发生的相互作用,一般复制开始后，就会进行到底，直到整个基因组都复制完毕。起始频率由起始位点和调控蛋白二者控制。第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况一、半保留复制semiconservativereplication二、复制起点、方向和方式三、DNA聚合酶与DNA聚合反应四、复制的基本过程五、DNA复制的半不连续性第四章 复制 Chapter 4 Replication五、DNA复制的半不连续性DNA复制的半不连续性semidiscontinuousreplication当DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的。冈崎片段OkazakifragmentDNA复制时，以53方向的链为模板时，呈不连续合成，形成的10002000nt的片段。前导链leadingstrand和后随链laggingstrand以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是35走向，在其上DNA是以53方向连续合成，称为前导链。另一条模板链是53走向，在其上DNA是以53方向合成，但是与复制叉移动的方向相反，形成不连续的片段，称为后随链。第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication第一节复制概况第二节复制体系第四章 复制 Chapter 4 Replication第二节复制体系一、复制体系的鉴定鉴定基因功能的方法通常是分析突变体的表型如果某个基因突变导致细胞不能复制，就可以说这个基因与复制有关。由于缺乏复制DNA的能力对细胞来说是致命的，所以我们能够得到的DNA复制突变体只能是条件致死突变体，它在合适的条件下可以完成复制，在非允许条件下(如高温，42度)则不能进行DNA复制。利用大肠杆菌的温度敏感突变体已鉴定了一系列的dna基因位点根据dna基因突变体在温度升高时表现出的性质，可将它们分为快停突变体和慢停突变体两类快停突变体当温度升高时，复制立即停止，它们缺失复制体系组分，特别是延伸所需的酶或参与供应关键前体的酶；慢停突变体在非允许温度下，还可完成当前的复制，但不能起始新的复制，它们的产物是从原点起始复制所必需的。纯化和重建也与突变一起鉴定参与复制的蛋白质体外互补实验是鉴定复制体系组分的重要手段从DNA突变体中分离出复制体系，此时突变基因的产物是无活性的，然后在非允许条件下加入相应野生型的抽提物，观察复制活性的恢复，通过鉴定抽提物中的活性组分确定dna基因编码的蛋白质。第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication第二节复制体系一、复制体系的鉴定二、DNA聚合酶第四章 复制 Chapter 4 Replication二、DNA聚合酶1.大肠杆菌的DNA聚合酶DNA聚合酶I参与损伤DNA的修复，并在半保留复制中起辅助作用。DNA聚合酶II参与修复。DNA聚合酶III是一个多亚基的蛋白质，是合成DNA新链的主要复制酶。第四章 复制 Chapter 4 Replication第四章 复制 Chapter 4 Replication(1)DNA聚合酶 编码基因polyA基因座,是第一个被鉴定的DNA聚合酶。 分子结构103kDa的单链多肽。 细胞内含量每个细胞内400个分子。 聚合效率每分种可催化1000个核苷酸的聚合。 催化活性53聚合酶活性；35外切核酸酶活性；53外切核酸酶活性。 水解片段用蛋白酶将其有限水解，可得到68kDa和36kDa的两个片段。68kDa称为大片段或Klenow片段。第四章 复制 Chapter 4 Replication(1)DNA聚合酶 Klenow片段的结构与催化活性C端的2/3具有聚合酶活性；N端的1/3具有35外切核酸酶活性。两个活性位点距离为3nm；表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。 小片段(35kDa)的催化活性与功能有53外切核酸酶活性。可以切除少量的核苷酸，一次最多切10个