液相色谱质谱联用

液相色谱质谱联用（LC-MS-MS)在食品检测中的应用张 辉,水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的检测,背景,性质：孔雀石绿(MG,又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿)是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料;常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂毒性作用：MG代谢物具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，并能在鱼体内长时间残留。加拿大在1992年发现人类若进食含孔雀石绿的鱼类，会对健康构成重大影响，主要是孔雀石绿中的三苯甲烷基团所致。,各国的管理要求 Codex： 无规定国际食品动物养殖业禁用药物 美国、欧盟、加拿大、日本、英国、泰國、新加坡等许多国家已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。欧盟（2004/25/EC）以2 g/kg （MGLMG总量）为执行限（MRPL），对象：水产品及其制品；中国：于2002年5月将MG列入食品动物禁用的兽药及其化合物清单中，禁用于所有食品动物。农业部第235号公告规定孔雀石绿的限量值(执行限）为0.5g/kg（GB/T 20361-2006 MG总量的LOD为0.5g/kg）,来自农业部 2007年城市水产品质量安全例行监测方案。,MG及其类似物CV孔雀石绿：(MG：孔雀石绿(MG,又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿)是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料)分子式：C23H25ClN2，分子量：364.92。隐形孔雀石绿（LMG）：分子式C23H26N2，分子量：330。具有光泽的结晶粉末，不易挥发，极易溶于水，水溶液呈兰绿色(4.0g/100ml)。能溶于乙醇、甲醇或戌醇。结晶紫（Crystal Violet，CV）：分子式：C25H30N3Cl，分子量407.98，熔点175-180。隐色结晶紫（Leuco Crystal Violet，LCV）：分子式：C25H31N3，分子量373.54，白色结晶粉末，熔点177。,孔雀石绿及其类似物,LC/MS/MS的质谱确证法液相色谱条件： 色谱柱:安捷伦ZORBAX Eclipse plus C18柱（2.1×100mm 3.5- micron） 流动相：乙腈-5mmol/L乙酸铵梯度洗脱 流速:0.4ml/min。 柱温：40 进样量：10L,质谱条件,离子化模式：电喷雾电离正离子模式ESI+干燥气温度350、干燥气流速11L/min；雾化器压力：35psi毛细管电压：4000V质谱扫描方式：多反应离子检测模式,质谱扫描方式：多反应离子检测模式 （MRM),标准溶液的配制 a)标准储备液：孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫各0.0100g 分别用甲醇溶解并定容至10mL，浓度为1mg/mL，-18冰箱 保存,有效期12个月 b)内标物：D6-孔雀石绿（100ug/ml）、D6-无色孔雀石绿（100ug/ml） c)基质加标标准工作曲线的制备：将标准储备液混合用初始流动相逐级稀释 成 0.1g/L10.0g/L 流动相的配制:5mmol/L乙酸铵:称取0.385g乙酸铵，加水至1000mL，加乙酸5滴，精密pH试纸在4.5左右。乙腈（色谱纯）c）初始流动相配比：乙腈+ 5mmol/L乙酸铵=75+25,操 作 步 骤（提取、净化）,均质样品称取5.0g 加入50.0L内标（200ng/ml） 加入25mL乙腈，混匀，超声15min离心10000r/min，10min5 ml乙腈活化中性氧化铝固相萃取柱（活化）5mL经离心后的样品上清液，上样，并收集流出液再加4 ml乙腈淋洗小柱并收集流出液（收集滤液共9.0mL）流出液用50以下氮气吹干用初始流动相溶解并定容至1.0ml（过0.22m滤膜上机测定）注：内标总质量10ng，取25mL提取液中的5.0mL净化、浓缩至1.0mL后上机测定，相当于该溶液浓度为2.0ng/g样品，与标准系列完全一致。,分析结果,孔雀石绿,结晶紫,无色孔雀石绿,无色结晶紫,孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫TIC色谱图,孔雀石绿MRM色谱图,无色孔雀石绿MRM色谱图,无色结晶紫MRM色谱图,结晶紫MRM色谱图,加标鱼样品提取物的MRM色谱图1.0ng/g,孔雀石绿、无色孔雀石绿、结晶紫、无色结晶紫标准系列0.2-2.0ng/g,动物源性食品中-受体激动剂残留检测方法,液相色谱质谱/质谱法（安捷伦6430）,-受体激动剂结构、分类,-兴奋剂：一类人工合成的苯乙胺类药物结构：分类：苯酚型及苯胺型性质：溶于多数极性或中等极性溶剂,方法原理、适用范围,a)方法原理 试样中-受体激动剂残留经酶解后超声提取，低温离心后，上清液用安捷伦PCX固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱测定，基质加标外标峰面积法定量。b)适用范围 猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、福莫特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A7种-受体激动剂类残留量的高效液相色谱质谱/质谱测定,质谱条件,离子化模式：电喷雾电离正离子模式ESI+干燥气温度350、干燥气流速10L/min；雾化器压力：35psi毛细管电压：2500V质谱扫描方式：多反应离子检测模式,色谱条件,色谱柱:安捷伦ZORBAX Eclipse plus C18柱2.1×100mm 3.5- micron）流动相：甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱 流速:0.3ml/min。 柱温：40 进样量：10L,质谱参数,样品提取过程,试剂：pH5.2乙酸乙酸钠缓冲液:称取3.0gNaAc·3H2O乙酸钠和约2.5mL冰乙酸，加水溶解并定容到1000mL水中。称取5.0g（精确到0.01g）样品，于50mL离心管中，分别加入500L 0.01mg/L内标液，混匀，静置10min，加入10mL pH5.2乙酸钠-乙酸缓冲溶液，混匀，加入100L -葡萄糖醛苷酶，37酶解16小时后取出冷却，超声振荡15min。410000r/min离心10min。倾出上清液，收集。残渣再用10mL pH5.2乙酸钠-乙酸缓冲溶液提取一次，410000r/min离心10min合并上清液。再离心，合并上清液过PCX固相萃取柱。,净化流程图,固相萃取净化PCX小柱,活化1） 6 ml甲醇2 ）6 ml水,上 样,淋洗1）6 ml水2）6 ml甲醇3）3 ml 0.1%甲醇氨溶液,洗脱6ml 2%甲醇氨溶液（收集）,收集，45氮气吹干1 ml甲醇：0.1%甲酸水溶液（5：95）定容LC/MS/MS检测,定容液的选择,结果分析（0.5-5.0ppb）,沙丁胺醇,特布它林,菲诺特罗,莱克多巴胺,克伦特罗,妥布特罗,苯乙醇胺A,基质加标2.0ppb,线性范围0.5-5.0ppb,注意事项,酶解的必要性安捷伦PCX淋洗和洗脱条件保证氨水的纯度！（尽量选择新购试剂）定容液中甲醇的比例（甲醇控制在10%以内）基质样品的必要性,动物性食品中硝基呋喃及其代谢产物残留量检测,背景,硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药。对多数革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌具有较强的抗菌作用。主要适用于肠道细菌感染及原虫病。低浓度抑菌高浓度杀菌几乎不溶于水和乙醇，但遇碱可分解，遇光颜色逐渐变深，应避光密封保存,几年前在畜牧、水产养殖中被广泛应用，后来研究发现，硝基呋喃类药物及其代谢物在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类。呋喃它酮有强致癌性，呋喃唑酮有中度致癌性，硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变。硝基呋喃类药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，结合态可长期保持稳定，从而延缓药物在体内的消除速度。这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此，当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。,限量要求,1993年美国禁止呋喃唑酮作为兽药使用。2002 年美国全面禁止将硝基呋喃类药物用于食源性动物。日本2006年5月实施肯定列表：不得检出 欧盟96/23/EC：不得检出，A类禁用药物 中国：2002.5起禁止使用,方法原理,在酸性条件下使硝基呋喃代谢物从结合态中游离，并在37避光条件下与2-NB衍生反应。,质谱条件,离子化模式：电喷雾电离正离子模式ESI+干燥气温度350、干燥气流速12L/min；雾化器压力：35psi毛细管电压：4000V质谱扫描方式：多反应离子检测模式,色谱条件,色谱柱:安捷伦ZORBAX Eclipse plus C18柱（2.1×100mm 3.5-micron）流动相：乙腈-5mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）梯度洗脱,流速:0.3ml/min。柱温：30进样量：20L,质谱扫描方式：多反应离子检测模式 （MRM）,动物性食品中硝基呋喃及其代谢产物残留量的LC-MS-MS标准操作程序,试剂：盐酸溶液：0.2mol/L。量取17mL浓盐酸用水定容至1000mL。氢氧化钠溶液：1 mol/L。称取40g氢氧化钠用水定容至1000mL。衍生剂：含2-硝基苯甲醛0.05 mol/L。称取0.075g含2-硝基苯甲醛溶于10mL甲醇，现用现配（不稳定，避光保存）。,酶解过程,均质样品1.0g,内标10ng 10ml 0.2M HCL, 0.3ml 2-NB,涡旋混匀,37避光振摇过夜,净化过程,1M NaOH 调PH 7.27.5（约1.0mL，不能超过PH8）,通过经3 ml甲醇、3 ml水预先活化的HLB固相萃取柱,（离心10000r/min，10min 上清液转入）,淋洗（3 ml水）,洗脱（5 ml甲醇）,洗脱液用氮气吹干,初始流动相定容至1.0ml（过0.22m滤膜上机测定）,分析结果（0.5-5.0ppb）,AMOZ,SEM,AHD,AOZ,线性范围0.5-5.0ppb,加标8.0ppb,注意事项,标准储备液一定要冷冻保存，且标准工作液现用现配衍生剂注意避光保存，现用现配，且衍生夜时应避光操作 调PH最好控制在7.2-7.5，一定不能超过8 调PH值最好使用精密PH试纸，避免交叉污染,谢谢大家,