实验步骤4

脂代谢相关基因 siRNA 沉默的实验步骤第一部分：siRNA 转染条件的优化及靶点筛选。写文章所需要的数据：1. 三对 siRNA 序列；2. 转染效率及图片；3. 对 mRNA 的抑制率及图片（非常重要）4. 对蛋白质的抑制率及图片（非常重要）实验步骤：1. 准备工作（1）培养瓶、玻璃吸管和枪头消毒；分装培养液、青霉素-链霉素和胰酶的管子消毒及分装；PBS 配置及消毒。（2）培养液分装 100ml/瓶，使用 100ml 玻璃瓶分装；青霉素 -链霉素分装 1ml/管，使用冻存管分装；胰酶分装 1ml/管，使用冻存管分装。（3）培养液的配置，每 100ml 细胞培养液（美国 Hyclone）中加入 10ml 血清（成都哈里生物）和 1ml 青霉素（10000U/mL）-链霉素（10000ug/mL） （美国Hyclone） 。2. HepG2 细胞复苏（1）从液氮罐中取出冻存管，塞入一次性手套（保护以免进水） ，直接浸入37温水浴中，并不时摇动使其尽快融化。（2）冰晶完全溶解后，取出冻存管。在超净工作台上打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到 10ml 离心管并滴加 10 倍以上的培养液，混匀。（3）800rpm 离心 5min。（4）弃去上清液，加入培养液重悬细胞，接种装有新鲜培养液的培养瓶，接种量以 1:1 进行复苏（1 冻存管分为 1 培养瓶进行培养） 。（5）37、5%CO 2 培养箱（Thermo ）中静置培养。（6）次日更换培养液一次，除去残留的二甲亚砜，继续培养。（7）根据情况传代三次后即可进行实验。3. 转染条件的优化（1）HepG2 细胞的胰酶消化。弃去培养液，加入 PBS 洗去残存的培养液和死亡细胞，洗三次。加入适量的 0.25%胰酶溶液（Hyclone） ，以刚好能盖住瓶底细胞层为宜，一般 0.5-1ml。在显微镜下观察消化过程，细胞间出现细小空隙时，去掉胰酶溶液。轻轻拍打瓶底，如果细胞全部漂浮于液体中，立即加入含有血清的培养液终止消化，并用吸管反复吹打分散细胞；如果部分细胞消化还不充分，仍贴于壁上，可放入 37培养箱中继续消化 30-60 秒后再轻轻拍打，直到全部细胞漂浮于液体中。（2） HepG2 细胞 24 孔板培养。 取 1 张 24 孔板。siRNA 设25nmol/L、50nmol/L 和 75nmol/L 三个浓度梯度，转染试剂设 1.5ul/孔和 3.0ul/孔两个浓度梯度，共 6 个处理。每个处理 3 次重复。将消化并稀释好的细胞均匀接种于 24 孔板中（2-6×10 5/孔） ，每孔接种 500ul。细胞密度长至 60%-80%时，进行转染实验。转染之前换无血清无抗生素培养液，每孔 250ul。1.5ul/孔25nmol/L 0 3.0ul/孔75ol/ 孔 孔（3）阴性对照 siRNA 转染复合物的配制。转染试剂为美国 Mirus 公司的TransIT-siQUEST reagent，使用前置手心中 warm 至室温，然后轻轻上下翻转混匀，分装后使用。siRNA 为荧光标记的阴性对照，出货时为冻干粉，打开管盖前离心，然后轻轻打开管盖，加入 62.5ul DEPC 水盖严管盖，振荡溶解，为20uM/L 的储存液。 25nmol/L siRNA×1.5ul/孔：不含血清不含抗生素的 DMEM 培养液 150ul置于消毒 EP 管中；加入转染试剂 4.5ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照 siRNA 储存液 1.2ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置 20min 形成转染复合物；加入 750ul 无血清的培养液，处理时每孔加入 50ul 即可。 25nmol/L siRNA×3.0ul/孔：不含血清不含抗生素的 DMEM 培养液 150ul 置于消毒 EP 管中；加入转染试剂 9.0ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照 siRNA 储存液 1.2ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置 20min 形成转染复合物；处理时每孔加入 50ul 即可。 50nmol/L siRNA×1.5ul/孔：不含血清不含抗生素的 DMEM 培养液 150ul置于消毒 EP 管中；加入转染试剂 4.5ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照 siRNA 储存液 2.3ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置 20min 形成转染复合物；处理时每孔加入 50ul 即可。 50nmol/L siRNA×3.0ul/孔：不含血清不含抗生素的 DMEM 培养液 150ul置于消毒 EP 管中；加入转染试剂 9.0ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照 siRNA 储存液 2.3ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置 20min 形成转染复合物；处理时每孔加入 50ul 即可。 75nmol/L siRNA×1.5ul/孔：不含血清不含抗生素的 DMEM 培养液 150ul置于消毒 EP 管中；加入转染试剂 4.5ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照 siRNA 储存液 3.4ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置 20min 形成转染复合物；处理时每孔加入 50ul 即可。 75nmol/L siRNA×3.0ul/孔：不含血清不含抗生素的 DMEM 培养液 150ul置于消毒 EP 管中；加入转染试剂 9.0ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照 siRNA 储存液 3.4ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置 20min 形成转染复合物；处理时每孔加入 50ul 即可。（4）阴性对照 siRNA 转染 HepG2 细胞。若细胞状态良好，可以进行转染实验，否则重新培养细胞。细胞密度长至 60%-80%时，换液，将配制的各种处理液滴加到各个处理孔中。滴加完毕，前后轻轻移动培养板使处理液均匀分布。置于培养箱中处理 6-24h，荧光显微镜下拍照计数。（5）转染率的计算。在荧光显微镜下，每人、每孔随机选取 1 个视野，计数荧光细胞数和总细胞数，计算转染率（转染率=荧光细胞数/ 总细胞数×100%） 。4. siRNA 有效靶点的筛选（1）HepG2 细胞六孔板培养。取 6 张六孔板，编号 1-6 号，1、3 和 5 号用于mRNA 的检测，2、4 和 6 号用于蛋白质的检测。共 7 个处理【3 对 siRNA+阴性对照（Negative control, NC）+ 转染试剂对照（Mock transfection, MT，用于检测转染试剂是否影响靶基因的表达量）+空白对照（Blank control, BC，不做任何处理，用于检测 HepG2 细胞中靶基因的本底表达） 】+阳性对照（Positive control, PC，用于验证实验操作的正确性） 。每个处理设 2 次重复。将消化并稀释好的细胞均匀接种于六孔板中（2-6×10 5/孔） ，每孔接种 2ml。细胞密度长至 60%-80%时，进行转染。（2）siRNA 转染复合物的配制。按照转染率最高的 siRNA 浓度进行配制。三对 siRNA 的配置方法：阴性对照的配制方法：转染试剂对照的配制方法：空白对照直接加不含血清不含抗生素的培养液。阳性对照的配制方法：（3）转染 HepG2 细胞。如细胞生长状态良好，可进行转染实验，否则重新培养细胞。共 7 个处理：3 对 siRNA，阴性对照，转染试剂对照，空白对照，阳性对照。每个处理 2 次重复。阴性对照 siRNA 与靶基因无任何相关性；转染试剂对照只加转染试剂进行处理；空白对照不做任何处理；阳性对照是经过验证的一定会沉默 3-磷酸甘油醛脱氢酶（管家基因，GAPDH ）的 siRNA。3 对 siRNA、阴性对照和阳性对照采用转染率最高的 siRNA 浓度进行转染。培养板细胞密度长至 60%-80%时，去掉原有培养液。将配制好的各个处理加入对应的培养孔，每孔加 2ml。换液完毕后，放回培养箱中处理 6h。6h 后PBS（或培养液）洗细胞，更换含有血清和抗生素的完全培养液。在培养箱中，将 1 号、3 号和 5 号放在同一位置，将在 48h 后检测其 mRNA 水平；将 2 号、4 号和 6 号放在同一位置，将在 48h 后检测其蛋白质表达水平。 48h 后消化收集细胞或上清液，将 2 个重复孔的细胞或上清液合并后用于提取 mRNA 和蛋白质。蛋白质冻存于-8 0备用。mRNA 逆转录成 cDNA 后冻存于 -80备用。siRNA-12si-3阳 性 对 照转 染 试 剂 对 照空 白 对 照阴 性 对 照 1#培 养 板3#培 养 板5#培 养 板 2#培 养 板4#培 养 板6#培 养 板48小 时 后 检 测 蛋 白 质48小 时 后 检 测 mRNA阳 性 对 照转 染 试 剂 对 照空 白 对 照阴 性 对 照 培 养 板培 养 板培 养 板 培 养 板培 养 板培 养 板小 时 后 检 测 蛋 白 质小 时 后 检 测（4）mRNA转录水平的检测。取转染后48h的cDNA，进行荧光定量检测靶基因的mRNA丰度。每个样品检测三次，得到三组数据。定量引物由大连宝生物工程公司设计合成。荧光定量试剂盒购自日本Takara公司，操作按试剂盒说明书进行。以GAPDH为内参照计算相对表达量（RQ） 。荧光定量 PCR 引物及产物大小基因名称 上下游引物（5-3） 退火温度 产物大小TACTCCTTGTTGTTGCCCTCCT 60.5载 脂 蛋 白 C-3（ APOCIII）ACGCTGCTCAGTGCATCCTT 60.6 136bpAAGGGCCTAGAGGAGCGTGT 60.5脂 肪 酸 合 酶 （ FASN）TGGTACTTGGCCTTGGGTGT 60.1 149bpCCACATGAACAGGCTTCCAGG 62.6乙 酰 辅 酶 A羧 化 酶 1（ ACC-1） ATTCGGTATGTGATGTCATTGCC61.4 126bpCTTTGGTATCGTGGAAGGACTC60GAPDH（内参） GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT59.6 132bp（5）蛋白质表达水平的检测。取转染后 48h 的上清液或靶提取蛋白进行检测。APOCIII 是分泌蛋白，采用 ELISA 试剂盒测定上清液中 APOCIII 的浓度；脂肪酸合酶和乙酰辅酶 A 羧化酶属于胞浆蛋白，消化收集细胞，提取总蛋白， Western 检测蛋白质表达。所有检测做三次，得到三组数据。ELISA 试剂盒购自英国 Abcam 公司。HRP-羊抗兔二抗购自武汉 Boster 博士德生物工程有限公司。脂肪酸合酶和乙酰辅酶 A 羧化酶 1 一抗购自美国 GeneTex 公司。用Quantity one-4.3.0 软件读取蛋白条带的灰度值，以目的片段和内参照 GAPDH的比值做蛋白相对表达水平。第二部分：沉默靶基因对 HepG2 细胞糖脂代谢的影响写文章所需要的数据：1. 脂代谢相关基因【包括载脂蛋白 B100 基因（ APOB100） 、载脂蛋白 CIII 基因（APOC3） 、脂肪酸合酶（FAS） 、肝脂酶基因（HL） 、微粒体甘油三酯转运蛋白基因（MTTP ） 、乙酰辅酶 A 羧化酶 1 基因（ACC1） 、乙酰辅酶 A 羧化酶 2基因（ACC2） 、固醇反应元件结合蛋白 1 基因（SREBP1） 、羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA ）还原酶基因】的 mRNA 表达水平及图片；2. 对 mRNA 表达水平有差异的蛋白质进行 Western 验证及图片；3. 细胞内外甘油三酯、胆固醇含量的测定，培养液中葡萄糖浓度测定实验步骤：1. 再次合成沉默效果较好的 siRNA，并进行化学修饰。由上海吉玛制药技术有限公司合成并修饰。2. 采用优化的转染浓度将化学修饰的 siRNA 再次转染 HepG2 细胞，以管家基因 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因。 48h 后，弃上清液，消化收集细胞，提取总 mRNA，采用