05 微生物农药(讲义5）

第三章 微生物农药,一、概述1 概念与定义 即传统概念上的生物农药，而且主要是指杀虫的微生物。,现代概念的微生物农药是指以活体微生物或者以微生物的代谢产物来作为农药，不仅是指杀虫活性，还包括杀菌、除草和植物生长调节活性等。微生物农药的概念可进一步扩展，定义为用来防治病、虫、草等有害生物的微生物活体及其代谢产物和转基因产物，并可以制成商品上市流通的微生物源制剂。,因此按功能作用来分，有杀虫、杀菌、除草和植物生长调节剂4大类；按有效成分分为：抗生素类、细菌类、真菌类、病毒类、原虫类、线虫类、微生物产生的植物生长调节剂类等七大类。,转微生物基因的植物，应该视为活体的植物农药，但活性成分是来自于微生物的。线虫，有人也把这类动物列为微生物农药，实际上线虫是属于动物类的。动物界的线虫门，有4万多种，1981才有人提出应用线虫防治害虫，因此，研究比较少。原虫，又叫原生动物，是单细胞动物或有单细胞组成的群体。传统上属于动物界，1980年以后属于原生生物界的一个亚界。也可以看成是微生物，目前已知有3-4万种，寄生在昆虫体内的就有1500多种，如锥虫、滴虫、变形虫、微孢子虫等。,从已上市的生物制剂对防治目标对象的作用机理来看，微生物农药最终起作用的物质基本都为具有一定化学结构的生物化学物质，如Bt和抗虫棉的(内毒素蛋白），白僵菌的白僵素，病毒分泌的酶，以及防治病虫草害的抗生素和植物生长调节剂等，都具特定的化学结构。按扩展概念来计算，我国微生物农药的产量或防治面积已占农药总产量或防治面积的l0左右，如井冈霉素一个品种的年产量(100有效成份04万吨)，就占杀菌剂总产量(45万吨)的9左右，加上其它品种如阿维菌素、赤霉素、Bt、农抗120、多氧霉素、白僵菌及一些病毒制剂的产量，它们占农药总产量的比例已接近l0。,2 微生物农药的特点,（1）对人畜安全、对病虫害的特异性强，不杀伤天敌和有益生物；（2）易被其它生物或自然因素所分解破坏，在环境中不易积累，对使用环境的污染少；（3）作用效果一般比较缓慢，作用机理比较复杂，常常有多种因素和成分发挥作用，害虫和病原物难以产生抗性。（4）可进行规模化生产，生产原料大多为农副产品，来源广，易生产；（5）各种品种生产工艺相似、设备相同，建一个工厂就可生产多品种。（6）可利用现代生物技术和基因工程技术对微生物和毒力基因进行改造，不断改进性能和提高质量。,3 细菌类微生物农药,我国对以Bt为主的细菌类农药品种的研究开发，一直比较活跃。如对Bt，除研究其作用机理、发酵工艺外，还研究Bt的工程菌和转Bt杀虫基因的植物。目前Bt制剂的生产厂家已达64家，年产量8万多吨（制剂），年应用面积达到5千万亩次以上；转Bt基因的农作物并产业化的品种已有抗虫棉和抗虫玉米、水稻等，年推广应用面积达到300万亩左右。,除Bt外，开发成功的细菌制剂还有亚宝(枯草杆菌)、力宝(假单胞杆菌)、增产菌(蜡质芽胞杆菌)、康地蕾得（多粘类芽孢杆菌）等。,4 病毒类农药,我国病毒资源丰富，“七五”、“八五”期间研究出了十几株具有较好开发应用前景的病毒株，其中棉铃虫核多角体病毒已登记注册，并形成年产百吨制剂的生产线，“九五”期间注册登记了斜纹叶蛾多角体病毒和粘病毒，使用面积每年达到百万亩以上。2002年，武汉大学生命科学学院与武大绿洲生物技术有限公司合作，研制成功的6个“武大绿洲菜园系列”病毒杀虫剂，分别是菜青虫、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、苜蓿银纹夜蛾的颗粒体和核多角体病毒利用生物工程技术获得的基因修饰及含有增效蛋白因子的病毒株系已处于开发生产阶段，从而使昆虫病毒产品的作用谱更广、防治效果更好。,5 真菌类微生物农药,昆虫病原真菌有700多种，而其中只有10余种用于害虫防治。目前，已经有50多个真菌杀虫剂品种。我国开展真菌制剂的研究开发已有30多年的历史，其中以白僵菌为最。目前虽然还未开发成功白僵菌制剂产品，但每年应用白僵茵防治松毛虫和玉米螟等的面积达1000万亩次以上。,本霉菌已开发成功，取得农药登记注册，用于防治蔬菜灰霉病具有较理想的效果和应用前景（主要有哈次木霉T. harzianum对立枯病、菌核病等有效)。目前，处于小试和中试阶段的真菌制剂还有绿僵菌(防治蝗虫)，淡紫拟育霉(防治植物线虫)、毒力虫霉(防治蚜虫)和蜡蚧轮枝菌(防治白粉虱)等。球孢白僵菌的研究也取得很大进展，主要是增强了球孢白僵菌侵染昆虫体壁过程中降解昆虫体壁蛋白酶和几丁质酶的能力。,6 微生物产生的植物生长调节类农药,我国开展植物生长调节剂研究的历史可追溯到50年代初，从5406细胞分裂素土法生产到赤霉素的开发成功和大面积应用，表明植物生长调节剂在我国农业生产中发挥了重要的作用。特别是赤霉素促进双季杂交水稻的分蘖、齐穗、早熟的作用，使其需求量急增，生产厂家达到40多个，成为植物生长调节剂中的当家品种。目前开发成功的由微生物产生的植物生长调节剂品种还有细胞分裂素、脱落酸等。,8 微生物除草剂,比较复杂，现在人们的概念是可以象农药一样防治特定的农田杂草的微生物。现在已经在国外广泛应用的微生物除草剂已经有10多种，但从登记的情况来看，主要是微生物的代谢产物，如：Fusarium solani,主要是用来防治大豆和棉花田的除草剂我国1963年即开发出真菌（黑盘孢目炭疽病属）鲁保一号，防治菟丝子；1978年利用链霉菌新种筛选出的农抗除草剂A和B，具有选择性除草和高效防治水稻白叶枯病的双重作用。,微生物杀虫药剂,活体微生物杀虫剂主要包括：,1 细菌性杀虫剂概述,昆虫病原细菌根据它们的寄主的专一性和作用的特殊方式而分为三种类型：专性病原菌 是一类专性寄生的芽孢杆菌，在自然界，只在寄主昆虫体内繁殖，对特定的昆虫寄主有很强的致病力，经消化道易传染。芽孢杆菌的金龟子乳状病原菌和梭状芽孢杆菌属细菌就属于这一类。 兼性病原菌 这是一类营腐生生活，也可寄生于昆虫体内的病原细菌，它们的寄主范围较广。细菌在昆虫宿主消化道内增殖，并侵入消化道内，造成寄主染病死亡。 潜在病原菌 多数为腐生菌，普遍存在于昆虫的消化道中，这类病原菌由于缺乏侵入昆虫肠壁的能力，很少造成昆虫的疾病。,细菌杀虫剂的种类,细菌杀虫剂（Bacterial insecticide）是利用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫细菌所含有的活性成分或菌体本身制成的，用于防治和杀死目标昆虫的生物杀虫制剂。杀虫细菌主要来自芽孢杆菌科Bacteriaceae、假单孢菌科Pseudomonadaceae、肠杆菌科Enteaobacteriaceae、乳杆菌科Lactobacillaceae 和微球菌科Micrococcaceae等细菌类群。,目前已知的杀虫细菌约有100多种，但被研制出产品并投入使用的主要是其中的4种，即苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus) 、日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)和缓病芽孢杆菌(bacillus lentimorbus)。前两种属兼性杀虫芽孢杆菌，它们既能在人工培养基上生长，亦能在昆虫体内繁殖；后2者属专性杀虫芽孢杆菌，它们一般要在昆虫寄主体内才能生长并形成有侵染力的芽孢。另外，也有少数其它芽孢杆菌及个别芽孢的细菌发展成产品。,2 苏云金杆菌类杀虫剂,苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种革兰氏阳性细菌，产生伴胞晶体，并能寄生于昆虫体内引起虫体发病的芽胞杆菌。1901年日本石渡Ishiwate首次从病死的蚕体中分离出这类病原体，命名为猝到杆菌（Bacillus sotto)1911年Berliner在粮业杂志上报道从德国苏云金的一个面粉厂1909年寄出的一批染病的地中海粉斑螟（Anagasta kuehnilla) 幼虫体内分离到这种产伴孢晶体的芽孢杆菌。1915年4月，他详细描述了该菌的形态和培养特征，并定名为苏云金杆菌（Bacillus thurmgiensis Berliner)，简称Bt。1938年，世界上第1个苏云金芽孢杆菌制剂Sporeine在法国问世，并用于防治地中海粉螟。从而掀开了苏云金芽孢杀虫剂生产的序幕。1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，伴孢晶体主要由分子质量130 KD da的-内毒素蛋白组成。,McConnell等（1959）发现Bt的部分菌株在发酵过程中可产生一种热稳定的-外毒素（苏云金素），并证明该物质具有一定的杀虫活性。Heimpel于1967年将苏云金杆菌产生的几种毒素它们划分为四类，即外毒素、外毒素(苏云金素)、外毒素、内毒素(伴孢晶体蛋白消化激活后产生的毒性肽)。,Zakharyan等1976年最先提出，质粒可能对伴孢晶体的编码起作用。接着，Debabov等和Galushka等1977年证实，苏云金杆菌含有质粒，它与伴抱晶体的形成有关。从而激起了苏云金杆菌遗传学研究的热潮。通过转化、转导、接合、融合等传递系统、使控制伴孢晶体形成的基因不仅在苏云金杆菌亚种之间，而且在不同种细菌之间，甚至与高等植物进行了转移或克隆，并获得了表达。 1981年，Schnept和Whiteley首次将HD-1菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。1987年，美国Monsanto公司用自己构建的Sev载体系统转移Kurstaki的内毒素基因，获得抗鳞翅目害虫的番茄转化株。,到目前为止，已分离出4万多个Bt菌种，报道了51个血清型（根据菌体细胞鞭毛抗原的特异性结合生理生化特性的区别特征分出血清型） ，50多个亚种，已克隆出60多个毒素基因，我国目前已经报道有17个血清型26个亚种。,苏云金杆菌的生长苏云金杆菌是好气性细菌，对温度发要求不严格，pH值7.0-7.2最适宜。其生活周期分为3个发育阶段芽孢休眠期：芽孢又称孢子，是休眠阶段，在干燥、高温或低温冷冻的条件下，能保存相当长的时间，它是保持种存活的形式。营养体时期：芽孢在适宜条件下，24小时萌发成营养体，46小时横裂增殖，610小时分裂增殖最旺盛。菌细胞以对数速度增长。810小时之后，营养体进入原生质凝集阶段，细胞分裂减慢，芽孢开始形成。孢子囊时期：在这一个时期，包括许多细胞学和生物化学的变化，结果在菌体细胞内形成卵圆形的芽孢。在芽孢的另一端则产生蛋白质伴胞晶体。, 苏云金杆菌产生的毒素内毒素 细胞体内含有的；外毒素 菌细胞在其生长过程中分泌于细胞外的代谢产物外毒素 卵磷酯或磷酸酯酶C，是一种对昆虫肠道有破坏作用的酶；外毒素 热稳定外毒素、耐热外毒素。由于这种毒素对家蝇有特异的致病作用，故也称蝇毒素。其产生与菌体的生长一致，在细菌生长过程中不断累积到培养基中。当细菌生长达最大时，毒素的产生也达最大量。芽孢开始形成时，毒素的产生也就完成。这一外毒素又叫苏云金素，有A、B两种。具有广谱的杀虫活性。对鳞翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目的30多种昆虫有不同程度的毒杀作用，对桔全爪螨等一些螨类也有效；外毒素 是一种或几种未经鉴定的酶，能使卵黄琼酯澄清。其毒力尚未证明。,内毒素 即伴胞晶体，又称晶体毒素，是一种蛋白质毒素，是苏云金菌的各类毒素中，研究得最多，又最为详尽的毒素。与芽孢形成同时生成，对热有一定的稳定性。65可保持1小时，80处理20min也不致破坏；晶体的形态多种，菱形较为常见。近年来人们又进一步从该菌发酵上清液中分离出Vips和具协同毒性作用的Zwittermicin A等活性成分。 在这些杀虫活性成分中，-内毒素（亦称 为“杀虫晶体蛋白”，Insecticidal crystal protein,ICPs）是最主要的,内毒素的致毒机理内毒素作为伴胞晶体亚单位存在时是无毒的。经溶解或蛋白水解酶水解后才变成有毒的多肽。伴胞晶体被敏感昆虫食入后，在中肠被强碱性的肠液（PH8.9以上）溶解，释放出一个或多个分子量为27000-140000Da的晶体蛋白，即为-内毒素。 -内毒素并被肠道蛋白酶水解释放出分子量更小的毒性多肽 。这些毒素被激活后，首先攻击的是中肠上皮细胞，并使中肠发生麻痹。影响中肠上皮的葡萄糖和离子吸收，可以作为神经毒素起作用，干扰寄主中肠细胞膜的运载过程，是中肠上皮细胞自溶的起动剂。另外，作为解偶联剂，破坏了中肠上皮细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化的正常功能。,