操作规程——小鼠腹腔巨噬细胞收集
一、目的一、目的 小鼠是流感病毒研究常用的动物模型。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞。收 集小鼠腹腔巨噬细胞，以进行后继实验，是动物实验操作的基本方法。本规程为 规范实验操作、保证样本质量、操作安全而制定。 二、范围二、范围 适用于中国国家流感中心所有技术人员进行小鼠腹腔巨噬细胞收集。 三、程序三、程序 （一）生物安全要求（一）生物安全要求 根据所使用病毒的生物安全条件在 ABSL-2、ABSL-3 或 ABSL-4 级实验室 条件下操作。 （二）材料（二）材料 10.5M EDTA：Gibco（Cat.15575-027）。 2RPMI1640：Gibco（Cat.11875-036）。 3FBS：Gibco（Cat.10091-148）。 4无菌细菌平皿：BD Falcon（Cat.351007）。 50.05%结晶紫：乙酸 2mL，结晶紫 0.05g，去离子水定容至 100mL。 （三）实验步骤（三）实验步骤 1将小鼠以颈椎脱臼法处死，仰卧，固定四肢。 2依次用碘酒、75%酒精消毒腹部，以镊子提取腹壁，剪去一小块皮肤，继 以镊子提取腹腔。 剪一小口， 以吸管注入少量冷 RPMI1640 培养液+EDTA （50mM）吸出，反复冲洗后再吸出，吸管在腹腔内各个位置吸取液体， 冲洗每只小鼠腹腔约共 5mL，整个过程不超过 30min。 31500rpm 10min，收集细胞，用冷 PBS 洗一次，20L 重悬细胞加入 20L0.05%结晶紫计数。 操作规程操作规程小鼠腹腔巨噬细胞小鼠腹腔巨噬细胞收集收集 41500rpm 10min， 重悬细胞于 RPMI1640+20%FBS（4106/mL），接种 于无菌平皿内，37，5%CO2孵育 90min。 5轻轻吸去未贴壁细胞，用预热 PBS 洗涤 2 次。 6加 RPMI1640+20%FBS 8 mL/无菌平皿，37，5%CO2孵育过夜。 7移去上清，加入冷 3 mL RPMI1640 培养液+EDTA（25mM），将细胞平 皿置于冰上 10min。 8用细胞刮子刮下细胞，整个过程不超过 30min。 91500rpm 10min，收集细胞，计数。 10重悬细胞于 RPMI1640+10%FBS（106/ mL），接种于 24 孔培养板内。
