组培室学员培训操作规程

组培室组培技术操作规程一、 植物组织培养概论及其技术原理组培室的定位：以引进、开发为基础，组培技术为手段，自主研发为突破，实现潜力品种的快速繁育和工厂化生产、新品种选育、种质资源保存。植物组织培养概念：又叫离体培养，是把植物离体的器官、组织或细胞，在营养基质上进行无菌培养的一种方法，用控制培养基成分及其他环境因素的方法，使培养材料定向的生长、分化与发育形成完整植株的过程。是植物无性繁殖的一种。原理：植物细胞的全能性（植物的每个细胞都含有该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力，原因是植物的所有细胞都是受精卵通过有丝分裂产生的，具有和受精卵一样的DNA序列和细胞质环境，只是受所在器官和组织的束缚，只能部分表达，一旦离体，在一定的营养条件和激素诱导下即可表达其全能性。）流程：生产方案制定、培养基制备、初代培养（启动培养、诱导培养）、继代培养（增殖培养）、生根培养、炼苗移植、定植或销售。分类：液体培养、固体培养（植株培养、胚胎培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养）。应用：种苗快速繁殖；苗木脱毒；新品种培育（胚胎培养，原生质体融合）；保存植物种植资源；生产植物性药品和生物制品（利用组织或单细胞的大量培养，提取蛋白质，香料、生物碱等化合物）组织培养的优点：培养材料经济；繁殖速度快、繁殖系数大；后代整齐划一，干形优良；能保持母本的优良性状；可获得无毒苗；管理方便、可工厂化生产二、 组培室药品及主要仪器设备的安全使用药品日常管理：1、安排专人保管，做好药品进出台账，杜绝过期药品入库。2、保持药品储藏条件。3、确保药品的质量安全，药品按规定的储存要求存放。4、对库存药品进行定期的质量检查，并做好检查记录。发现有质量问题，应立即停止使用，并第一时间通知部门负责人；5、按规定建立药品出库记录，对近期无法使用的药品和过期药品应及时上报，做到“无差错，无丢失，无变质”；6、药品使用人员应具备相应的药品安全知识、使用规范及称量规范；7、药品使用完毕后，使用人应将剩余药品放回。药品使用注意事项：1、配药时配药人员要戴胶皮手套，称量时按照配方准确称量。2、药品不得用手触碰，不得用嘴尝试，称量后药匙所剩药品不得放回原药瓶。3、用药工作结束后，将药品放回原处，所用工具清洗干净并用纯水润洗三遍。应急处理：1、皮肤接触药品：立即脱去污染的衣着，用大量流动清水冲洗；若感不适立即就医。2、眼睛接触药品：立即提起眼睑，用大量流动清水或生理盐水彻底冲洗至少15分钟；若感不适立即就医。3、吸入药品：迅速脱离现场至空气新鲜处，保持呼吸道通畅；如呼吸困难，立即进行心脏胸外挤压术（严谨进行口对口式人工呼吸）。4、食入药品：立即给饮植物油1530mL，催吐，并立即送往医院救治。5、各部门制定完善的应急救援预案，并组织反事故演练，充分做好各项应急准备工作，降低事故造成的人身伤害。常用仪器设备安全操作压力蒸汽灭菌器1、灭菌液体时，应将液体罐装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好。须待压力表指针回复到零位后方可打开。 2、对不同类型，不同灭菌要求的物品，如辅料和液体等，切勿放在一起灭菌，以免顾此失彼，造成损失。3、取放物品时注意不要被蒸气烫伤，可戴上线手套。 4、在日常使用过程中如发现螺丝、螺母松动现象，应及时加以紧固，确保正常使用。5、平时应用洁布擦拭设备，保证设备的清洁和干燥，以延长使用年限。6、一旦发现问题，立即切断电源，联系专业人事维修。电子天平使用注意事项1、将天平置于稳定的工作台上避免振动、气流及阳光照射。 2、在使用前调整水平仪气泡至中间位置。3、电子天平应按说明书的要求进行预热。4、称量易挥发和具有腐蚀性的物品时，要盛放在密闭的容器中，以免腐蚀和损坏电子天平。5、经常对电子天平进行自校或定期外校，保证其处于最佳状态。6、如果电子天平出现故障应及时检修，不可带“病”工作。7、操作天平不可过载使用以免损坏天平。臭氧发生器臭氧发生器是一种释放臭氧离子，通过释放的臭氧离子可以损伤病菌或病毒的蛋白质和酶分子，从而导致其功能改变。因此，臭氧与生物物质的作用是通过DNA分子直接吸收导致的DNA损伤的作用，以及被某些色素吸收导致活性氧产生，与周围DNA、蛋白质、酶、细胞膜等生物分子反应的间接作用进行的。臭氧不仅对微生物有致命的影响，臭氧对眼、鼻、喉有刺激的感觉，浓度高时，会出现头疼等症状。臭氧发生器的使用要严格按照仪器使用说明书进行使用，臭氧发生器的使用一般是通过电子时控器进行开关的控制，在臭氧发生器开启的时段内，要确保无人员的出入，且门窗关闭，以达到较好的灭菌消毒效果。臭氧发生器停止工作后，人员不可立即进入培养室，一般2-3小时后方可进入，原则上是进入培养室内的人员问不到臭氧的味道为准。一旦发现有人头晕脑胀，立刻空旷透气的地方，情节严重者立即就医。紫外灯紫外线不仅对微生物有致命影响，对人也有一定的致癌作用。 因此，当植物组织培养或细胞工程实验室在用紫外线消毒期间，工作人员不要处在正消毒的空间内，更不要用眼睛注视紫外灯，也要避免手长时间在开着紫外灯的超净工作台内进行操作。一般在接种室用紫外线消毒后，不要立即进入接种室，此时室内充满高浓度的臭氧，会对人体，尤其是呼吸系统造成伤害。应在关闭紫外线灯1520分钟后再进入室内。酒精的安全使用组培室内使用的酒精浓度分为95%和75%。，酒精灯的酒精浓度为95%，对手、臂消毒的酒精浓度为75%，在使用过程中，我们都进行严格的标记，看好标记再进行使用，千万不可混用。组培室内应备用灭火器，并及时检查。（一般用干粉灭火器，切记不可使用泡沫灭火器），也可用细砂，湿抹布，用于隔断氧气。三、 常用培养基和激素的种类及特点常用培养基种类及特点常用激素种类及特点生长素类：促进生长。IAA活性相对较弱，对器官形成的副作用较小，高温高压、见光易分解，也容易被植物体内的吲哚乙酸氧化酶分解氧化。NAA比较稳定，比IAA活性强，应用较广泛（一定浓度下促进叶生长较好）。IBA诱导生根能力较强。2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）启动能力很高，促进愈伤形成活力强，会抑制侧芽生长。 活性：2，4-DNAAIBAIAA细胞分裂素：促进细胞分裂，促进侧芽生长，抑制根的形成，打破顶端优势。 活性：TDZ（噻苯隆）CPPU（吡效隆、KT-30）ZT2-ip(2-异戊烯腺嘌呤)6-BA（6-苄基腺嘌呤）KT（激动素）赤霉素：主要用于幼苗茎的伸长生长，还可以打破休眠，主要在壮苗期使用。激素使用的量不是绝对值而是相对值，不同植物使用量不同，同种植物不同阶段、不同周期的使用量也不尽相同。四、 母液及培养基的配制母液配制及注意事项母液分为：大量、微量、有机、铁盐大量：一般大量和钙离子化合物，一般分开配制，以防产生硫酸钙、磷酸钙沉淀（MS大量配制可分开溶解，后将钙离子化合物缓慢倒入其他大量中，然后定容至指定量）。大量药品较多，一般母液倍数较小。微量：微量不易溶解，可单一溶解，后混合定容。有机：糖、维生素、肌醇、氨基酸、腺嘌呤、天然复合物等。有机物容易产生絮状物（实则为霉菌）。铁盐：Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二钠），FeSO47H2O分别溶解；Na2-EDTA电炉加热至微沸，将FeSO47H2O缓慢倒入，边倒边搅拌，加热至金黄色，调节PH5.5。激素的配制：可以根据常用浓度来选择配制浓度，方便移取。一般的激素可用乙醇溶解，或者用氢氧化钠、盐酸。母液配置完成后，标记配制倍数或浓度、详细日期，每升培养基所取量，放入2-4度冰箱保存，如发现絮状物或结晶沉淀则不可再用。培养基的配制冷水琼脂加热溶解煮沸糖药品沸腾停止加热定容激素调节PH容器及其他准备分装灭菌注意事项：配制培养基之前检查母液是否有絮状物或沉淀产生；培养基配制一般使用纯水；加入糖时一定要不停的搅拌；如果需要加入活性炭，需在调节PH之前加。五、 无菌操作流程及注意事项接种室外准备工作1、换上拖鞋，将自己的鞋整齐的摆放的鞋架上。2、进入更衣室，穿上无尘服，将无菌操作服衣袖卷至手臂，切记自己的衣袖不可露于无菌操作服衣袖的外面。将头发全部挽入操作帽内，防止头皮屑掉落。3、清洗手指、手臂。 4、洁净室的每一道门都要保持关闭状态，记住随手关门。接种室内准备工作1、自动控制器需在工作前20分钟打开无菌操作台的风、灯开关暖机（注意：发出蓝紫色光的为紫外线杀菌灯，长时间照射眼睛会刺痛）。2、将垃圾筐内套上垃圾袋。3、将无菌操作台按照从上到下顺序用75%的酒精擦干净4、用小台车将当天所需的组培苗和培养基瓶一次性运够。请注意组培苗的每一瓶代号要看清确定为自己所需，培养基代号要分清，不能100%确定的不能用5、将当天所用的工具（长短镊子、剪刀、解剖刀、勺子、试管、广口瓶等酒精、纱布、口罩、油性笔等）准备好。消毒工作1、手进入操作台前先用75%的酒精将手、手臂消毒方可进行下一步操作。2、将操作台里的消毒器、工具（镊子、剪刀、勺子），工具架，酒精灯等消毒全面且擦拭干净。镊子、刀柄、剪子等工具水平放置在操作台最里面 放置时切记不可将高效滤网（网格后面折叠纸状）扎破。3、将已经消毒好的工具（镊子，剪刀，解剖刀，勺子）插到消毒器的石英砂中。（注意：尽量插深，以便工具能消毒彻底）4、将消毒器开关打开，加热灯亮，正常加热，20-30分钟后恒温灯亮，说明加热完毕，此时工具可以取出，放在工具架上冷却，注意取工具时，将工具迅速从石英砂中拔出，工具若碰到消毒器的任何部位必须重新将工具消毒， 20-30秒方可彻底消毒，（注：工具在消毒器中时间不宜过长以免冷却不彻底烫伤组培苗）。如果消毒器出现异常（如：恒温灯一直不亮等，及时反馈）。操作流程 1、操作前检查：仔细查看原组培苗的品号是否为自己所需，组培苗是否感染，确定没问题后方可进行下一步操作。如发现原瓶感染和异常情况要及时汇报，须经管理人员确认后再做处理。2、培养基原组培苗消毒：将未消毒的原组培苗和培养基瓶放置于操作台最外面以放5瓶为标准，如放太多会造成操作台过度拥挤，易不慎感染。用75%的酒精将培养基瓶和原组培苗瓶转圈喷湿，用喷湿的纱布先擦培养基瓶，再擦原组培苗瓶，要小心全面擦拭干净，消毒彻底后放入操作台最里面。3、开培养皿：酒精消毒后将报纸打开，把培养皿推置操作台最里侧。（培养皿前方不可有任何物品，确保风可以吹过。）4、开瓶：开瓶时先开原组培苗后开培养基。开原组培苗：火烤原组培苗（火烤时间不可过长，以免组培苗被烫伤），将擦过的原组培苗移至火焰上方，瓶口向上倾斜45均匀火烤2圈后，方可开瓶（火焰前方菌类存在的几率小），开瓶后快速火烤瓶口，将原组培苗的瓶塞放在操作台外侧；然后用同样的方法开培养基，培养基的塞子迅速火烤后放在右侧最里边（塞子前方不能放任何物品）。注意：用手开瓶时，拇指切记不可接触到瓶口。烤瓶口时，要火烤均匀，不可局部加热（瓶子易炸裂），以均匀火烤转2圈为宜；要在火焰前方开瓶。5、移苗：从工具架上拿起镊子，把镊子放入培养基瓶中冷却（手不能挥过瓶口，工具应倾斜，镊尖应中自然张开倾斜插入培养基免培养基被划破）。待工具冷却后开始进行组培苗转移工作，首先将苗子转移到培养皿中，移苗时所有动作均应水平移动，手与工具切记不可挥过瓶口及培养皿上方，往培养基皿中放苗时，工具应倾斜于培养皿上方，不可垂直（目的是防止搅动操作台内水平吹出的空气和防止菌落掉入培养皿内。注意事项：（1）夹苗时不可从瓶口上方去看应该透过瓶壁去看（2） 夹苗时不能夹伤叶片，要夹苗的基部或根部。6、切苗：切苗