临床化学主管检验师学习资料 (12)

临床医学检验主管技师考试辅导临床化学 诊断酶学一、血清酶（一）血清酶的分类1.血浆特异酶：在血浆中发挥特定催化作用的酶。如胆碱酯酶、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。大多数在肝内合成。血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。2.非血浆特异酶：在血浆中浓度很低，且无功能。（1）分泌酶：来源于外分泌腺的酶。如胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。血液中分泌酶以失活状态存在，不发生催化作用。在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。（2）代谢酶（细胞酶）：在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床意义很少。 这一类酶较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏病时都可能出现变化。（二）血清酶生理变异及其病理生理机制1.血清酶生理变异（1）性别：CK和GGT都是男性高于女性。（2）年龄：碱性磷酸酶（与骨生长发育相关）。（3）进食：酗酒可引起-GGT明显升高。（4）运动：剧烈运动可引起血清中多种酶升高，如CK、LD、AST等。（5）妊娠与分娩：妊娠时ALP升高，分娩时可能有CK、CK-BB、LD升高。2.血清酶病理改变机制：（1）酶合成异常：血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。如血清胆碱酯酶活性在有肝功能障碍时可能下降。由于酶基因变异也可引起特定酶减少或消失，如肝-豆状核综合征患者血中铜氧化酶活性可明显下降。如有骨细胞增生时，血中ALP可上升。（2）细胞酶的释放：是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：1）细胞内、外酶浓度的差异；2）酶在细胞内的定位和存在的形式；3）酶蛋白分子量的大小：酶释放的速度和分子量成反比。例如LD分子量大于CK，而当有心肌梗死时，LD在血液中升高的时间就晚于CK。（3）酶在细胞外间隙的分布和运送：细胞中酶有三种途径进入血液1）血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液；2）酶可同时进入血液和组织间隙，后者再入血；3）酶大部分进入组织间隙后再入血。（4）血液中酶的清除：不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期等因素有关。（三）酶活性和质量测定方法及其评价1.酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：1）定时法（两点法）：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中t1往往取反应开始的时间。在酶反应一定时间后，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等使反应完全停止，也叫中止反应法。2）连续监测法：又称动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。（2）按监测方法分类法：1）分光光度法2）旋光法3）荧光法4）电化学方法5）化学反应法6）核素测定法7）量热法2.酶质量测定法：利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng/ml、g/L来表示酶含量的高低。与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响。当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。如肌酸激酶同工酶MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。（四）酶活力测定的影响因素1.反应速度：大多数酶促反应是可逆反应，其速度既受底物浓度的影响，也受产物生成量的影响。酶反应动力学中所指速度就是反应的初速度。2.底物浓度：米氏方程是反映酶促反应速度与底物浓度关系的方程式，其中Km称米氏常数（只与酶的性质有关，而与酶浓度无关）。Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。测定酶活力时，必须注意以下几点：（1）酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。（2）要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的1，pH应恒定。（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。（4）标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱及蛋白沉淀剂等。（五）工具酶1.NAD（P）或NAD（P）H偶联的脱氢酶及其指示反应：NADH和NADPH在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度计检测，还可通过荧光法2.偶联H2O2的工具酶及其指示反应：有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2，后者在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使相应底物被氧化，生成H2O2，H2O2可通过下列指示反应来检测。（1）使单一的色素原显色：色素原是一种无色的色素前身，在过氧化物酶（POD）存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。如邻联茴香胺（ODA）。（2）使成对的色素原显色：必须有两个色素原共同存在，再在过氧化物酶（POD）的催化下生成色素。如酚和4-氨基安替比林作用，生成红色色素。（3）发光反应：H2O2也可用化学发光反应来监测。（六）标本采集要点及酶活性表示法1.标本采集要点：（1）不能溶血：因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。如LDH高150倍，ALT高7倍。（2）及时分离血清：防止血细胞内酶进入血清。（3）尽量用血清标本：防止某些抗凝剂对酶的抑制作用（除外测定与凝血或纤溶有关的酶）。（4）及时测定：防止酶蛋白变性。（5）大部分酶在低温中比较稳定。常用酶如ALT、AST、ALP、CK、GGT、和AMY，冷冻保存在10个月活性变化不大。但有些酶如LD在融冻时被破坏，LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。2.酶活性表示法：通常以酶单位数表示。国际单位的含义是：在实验规定的条件下（温度、最适pH、最适底物浓度时），在1分钟内催化1mol底物发生反应所需的酶量作为1个酶活力国际单位（U）。（七）同工酶和亚型测定的临床意义同工酶是指其分子组成及理化性质不同但具有相同催化功能的一组酶。同工酶对疾病的诊断和鉴别诊断很有帮助，可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定。现在可用免疫学原理测定同工酶。1.构成：一般由多亚基构成，亚基不同组合方式构成不同形式。例如：乳酸脱氢酶（LDH1LDH5）由H亚基和M亚基构成的四聚体。2.分布特点：明显的组织器官特异性、细胞内定位不同、有些同工酶在不同发育阶段类型不同。3.临床应用（1）可根据同工酶的变化为推测受损组织或器官。如CK-MB活性增高对判断心肌梗死有意义。心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰引起肝淤血的状况。（2）可判断某些疾病的程度和预后如线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进入血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。有些同工酶在从组织进入体液后，可进一步分化为几个不同的类型，即所谓同工酶亚型。CK-MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3。这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。二、常用血清酶和同工酶测定的临床意义（一）连续监测法测定血清肌酸激酶（CK）CK作用后生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。1.原理：酶偶联反应测定CK活性浓度在340nm监测NADPH的生成量，可计算出CK的活性浓度。2.生理变异：新生儿CK常为正常成年人的23倍；男性参考值高于女性；白种男性CK均值为黑种人的66%。3.参考值：男性38174 U/L（37）。女性26140 U/L（37）。4.临床意义：（1）CK主要用于心肌梗死的诊断：心肌梗死发生后24h此酶即开始升高，1248h达最高峰值，可高达正常上限的1012倍，在24d降至正常水平。此酶对诊断心肌梗死较AST、LD的阳性率高，特异性强，是用于心肌梗死早期诊断的一项较好指标，同时对估计病情和判断预后也有参考价值。（2）病毒性心肌炎时CK也有升高。（3）肌营养不良症、皮肌炎、骨骼肌损伤等也可致CK升高。（4）脑血管意外、脑膜炎、甲状腺功能低下等疾病及一些非疾病因素如剧烈运动、各种插管及手术、肌肉注射氯丙嗪（冬眠灵）和抗生素等也可能引起CK活性增高。（5）甲状腺功能亢进，长久卧床者总CK（主要为CK-MM）可下降。（二）连续监测法测定乳酸脱氢酶（LD）总活性LD是由两种不同的亚基（M、H）构成的四聚体，形成5种同工酶。即LD1（H4）、LD2（H3M）、LD3（H2M2）、LD4（HM3）、LD5（M4）。这5种同工酶大致可分成三类：以LD1为主，主要在心肌，可占总酶的50%，也存在于红细胞内；以LD5为主，存在于横纹肌，肝中也有；LD3为主，存在于肺、脾。1.原理：340nm处吸光度增加速率与样品中LD活性成正比。2.生理变异：婴儿酶活性可达成年人两倍，儿童和少年活性比成年人高10%15%。血清LD同工酶在成年人中：LD2LD1LD3LD4LD5。3.参考值：血清LD：109245U/L（成人）4.临床意义： 疾病LD总酶LD同工酶心肌梗死升高最慢（810d）升高时间长（510d）可高于正常上限10倍LD1LD2，可持续两周充血性心衰，心肌炎可高于正常上限5倍LD1LD2病毒性肝炎部分患者可高于正常上限5倍LD5LD4肝硬化轻度升高LD明显升高，LD5LD4原发性肝癌部分病例升高同上梗阻性黄疸不定常LD4LD5肌肉损伤视损伤程度而异以LD5升高为主恶性肿瘤可增高以LD3为主，LD3LD1（三）连续监测法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）氨基转移酶主要包括ALT和AST。ALT和AST在于体内多种器官和组织中，以含量从多到少为序，AST