化学发光法的原理技术要点及评价应用.
化学发光免疫技术,第一节 发光与化学发光剂 第二节 发光酶免疫测定（CLEIA） （chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA) （chemiluminescence immunoassay） 第四章 电化学发光免疫测定技术(ECLI) (electrochemiluminescence immunoassay),化学发光免疫技术：集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。,概 念,特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。,化学发光免疫技术的类型,按发光剂不同分为 1.发光酶免疫测定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化学发光免疫测定技术(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.电化学发光免疫测定技术(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定,第一节 发光与化学发光剂,一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。,1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。,2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。,3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程。,荧光素酶 ATP；O2；Mg2+,氧化萤火虫荧光素,萤火虫荧光素,生物发光,返回,光 + AMP+ O2 + CO2 +,化学发光,机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。,二、化学发光剂,化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂,能参与化学发光反应； 与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； 应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。,化学发光剂应符合以下几个条件,返回,1.酶促反应的发光底物,是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物） 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物,1.1 鲁米诺,H2O2 /OH HRP,+N2 + H2O +光,对-羟基苯乙酸（HPA）,HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。,1.2 HPA,H2O2 HRP,+荧 光,氧化二聚体,AMPPD,AMPPD在碱性条件下，被AP酶解生成相当稳定的 AMP-D阴离子，其有230min的分解半衰期，发 出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度 达到高峰，1560min内光强度保持相对稳定。,光,AP /OH HPO4 2,1.3 AMPPD,4-MUP,4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的 激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧 光光度计进行测量。,荧光,AP,1.4 4-MUP,4-MU,360nm 激发光,H3PO4 +,2.直接化学发光剂,特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。 常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）,+ CO2+ 光,3.电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。 特点：反应在电极进行； 电子供体为：三丙胺（TPA） 化学发光剂：三联毗啶钌,返回,三联毗啶钌 分子结构图,第二节 发光酶免疫测定（CLEIA）,一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。,二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术,根据免疫学反应模式分 1.双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.固相抗原竞争法：,荧光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤 弃上清,是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有 强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。,化学发光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤 弃上清,是利用酶对发光底物催化作用而直接发光， 通过光强度的测定而直接进行定量。,电化学发光原理图,这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子，使光信号增强,返回,激发态 不稳定,基态,电极,1.抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间 后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗 体-抗原-酶标抗体复合物,技术要点,2.分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓 冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗 原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。,3.酶促发光反应 加入4-MUP，酶标抗体上AP将 4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激发光的照 射下，发出448nm的荧光，经荧光仪记录，放大， 根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量,1.磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒,与标 本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过 一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合 酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。,分离技术,2.微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为 抗体或抗原的包被载体, 然后用纤维膜柱子进 行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。,3.包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在 小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.,第三节 化学发光免疫测定技术（CLIA）,一、原理 用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与 待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反 应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离 状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入 发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的 检测进行定量或定性检测 。,二、技术类型 1.分离方法 常用磁颗粒分离技术 2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术 3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶,1.抗原抗体结合反应 将包被McAb的磁颗粒和待 测标本加入到反应管中，标本中待测Ag与磁珠 上Ab结合，再加上AE标记Ab，经过温育，形成 磁珠Ab-Ag-AE标记Ab复合物。,技术要点,2.分离技术 在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快 地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。,3.化学发光反应 经洗涤的磁珠中，加入H2O2和 pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录1S内所产生的光子能，其积分与被测物含量 成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。,1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催 化剂。,方法评价,2.AE与大分子的结合并无减少所产生的光量， 从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml。,3.AE标记试剂有效期长，可达一年。,4.固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被 面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更 简易、快捷。,第四节 电化学发光免疫测定技术（ECLI）,一、原理 是一种在电极表面由电化学引发的特 异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化 学发光二个过程。ECL是电启动发光反应，而CL 是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光 剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。,二、技术类型 1.分离方法 常用磁颗粒分离技术 2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术 3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶,1.三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本 同时加入一个反应杯中孵育反应,技术要点,2.将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次 孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合， 将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。,3.蠕动泵将形成的 Ru(bpy)32+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠 复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁 吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。,4.蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。 该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子， 光电倍增管检测光强度，其与Ru(bpy)32+的浓度呈 线性关系,故可测出待测Ag的含量。,原理图,返回,抗体包被 样本 Ru(byp)2+ TPA缓冲 的磁珠 抗原 标记抗体 液洗涤,3,方法评价,标记物的再循环利用，使发光时间更长、强 度更高、易于测定； 敏感度高，可达pgml或pmol水平； 线性范围宽104； 反应时间短，20min以内可完成测定； 试剂稳定性好，25可保持一年以上。,五、临床应用,1.甲状腺激素 2.生殖激素 3.肾上腺/垂体激素 4.贫血因子 5.肿瘤标记物 6.感染性疾病 7.糖尿病 8.心血管系统 9.病毒标记物 10.骨代谢 11.过敏性疾病 12.治疗药物监测,返回,
