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怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发课件

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怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发课件

液相色谱柱的选择和方法开发,奥秘科技/AUMI Technologies (US),内容概要,色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发,色谱基本概念回顾,色谱(chromatography),色谱原理 色谱分类:气相/液相和高效液相(HPLC);反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能:分析(种类/定量),纯化 液相色谱仪器结构及功能:泵,脱气机,混合器,进样器(阀),色谱柱,柱温箱,检测器(流通池),分离度,Rs - Resolution N Theoretical Plate Number Selectivity k Retention Factor 拖尾,1.Separation of Compounds A and B,灵敏度,:Limit of Detection :Limit of Quantification 柱效 峰形(拖尾因子),重现性,分离度() 保留时间(,) 选择性( ) 柱效() 灵敏度,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响,分离度 - 选择性 键合类型,基质表面特性;流动相、温度 - 柱效 保留体积,粒径,柱长,基质表面特性;流动相, 温度,上样量,流速 峰对称性 基质表面特性,键合类型,流动相,温度 保留体积 柱长,孔隙率,比表面积,基质表面特性,键合类型;流动相,温度 灵敏度 粒径,基质表面特性,键合类型;流动相,温度 稳定性和重现性 基质表面特性,键合类型;流动相,温度 流动相 pH,缓冲盐种类,溶剂;,影响色谱柱性能的主要因素,1、 色谱柱的构型 色谱柱内径 色谱柱长度 2、 固定相柱填料 粒径 比表面积 孔径 孔隙率 基质表面特性: - 表面活性:硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响:长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响: 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) 满足检测器和样品量限制 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高,抗污染,寿命 制备柱 (内径 10 mm) 用于纯化制备,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响:粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响:粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m,1.8m,2.2m 快速液相色谱柱:匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层:在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m,3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析,颗粒越小,柱效越高, 但是耐污染性能下降,柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响:比表面积,每克填料的表面积,与粒度,孔径有关 比表面积大,保留增加,载样量增加,平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响:孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部 样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部 孔径至少是样品流体学直径的4倍 300孔径用于:超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响:孔径II,由于小孔径填料比表面积大,小分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件:C8色谱柱,4.6150mm,3.5um, A溶剂,0.1%TFA水溶液; B溶剂,0.1%TFA于80%乙腈水中; 20min梯度,1030%B;60C,1.5ml/min,柱填料对C18色谱柱性能的影响:硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,!,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=?,流动相: 甲醇:水=65:35 流速: 1 mL/min 温度: 35 检测波长: 230 nm 进样量: 20 L,硅胶纯度金属含量,硅胶基质类型及发展史,Type A:原料来源:水玻璃;高金属含量,高活性,极性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B:原料来源:有机硅烷(四乙氧基硅烷)水解/烧结/酸洗 杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱,柱填料对C18色谱柱性能的影响:硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,固定相对色谱柱性能的影响:硅羟基的影响,残余硅羟基的影响 普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时,表面的硅羟基会带负电荷,碱性化合物拖尾。 解决方法 封尾 双层表面修饰 表面杂化,固定相对色谱柱性能的影响:残余硅羟基的影响,封尾 键合填料与小硅烷进行后续反应,如三甲基氯硅烷,反应掉部分残余硅羟基,以增加表面覆盖率。 缺点: 不能完全反应(仍有50%的硅羟基未被反应) 在pH<3时,TMS易流失,耐用性,稳定性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响:残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响:残余硅羟基的影响,双层表面修饰 降低表面硅羟基活性,硅胶表面更加均匀,固定相对色谱柱性能的影响:残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后 新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟基pH=5.2, 普通硅羟基pH约为3.5 更对称的峰型,提高柱效,提高灵敏度 硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖 重现性更好 表面纯度更高硅胶金属杂质被覆盖 极性化合物保留和分离更好,键性化合物峰形对比,Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm,Brand A C18( non-endcapped, ),C18 (non-endcapped, twin-layer,ASB C18,Zorbax SB C18,Saponins Extract,4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20,固定相对色谱柱性能的影响:残余硅羟基的影响,双层表面修饰 代表产品: StableBond C18,PolarBond C18,SurfBond C18,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,AUMI Baulo StableBond C18, 2.150mm, 5m,Brand A C18 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.050mm, 5m,固定相对色谱柱性能的影响:键合类型,A 纵向交联:保留和选择不稳定 B 横向交联:宽pH适用 C 单体键合:重现性好,柱效高 D 单体(空间保护):低pH稳定 极性官能团嵌合反相固定相,固定相对色谱柱性能的影响:基质表面特性+键合类型 反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱: 保留值随含碳量的增加而增加 比表面积越大,保留值越大 键合碳链越长,保留越大 C18 C8C3C1,长链之间差别不大,反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的 保留值,选择性与峰型 色谱柱:4.6*150mm,流动相:乙腈0.05M磷酸钾缓冲液,pH3.2(65:35);流速:1ml/min,,拖尾峰,T0(尿嘧啶),P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯,固定相对色谱柱性能的影响: 基质表面特性+键合类型 键合相的稳定性,键合相的稳定性 低pH值,键合相流失 高pH值,硅胶溶解 影响色谱柱寿命,方法不重现,键合类型对键合相稳定性影响,低pH值,键合相流失,键合类型对键合相稳定性影响(II),空间位阻保护,延缓键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响: 键合硅胶的稳定性,高pH值,硅胶基质溶解,pH9时,色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响: 键合硅胶的稳定性,碳杂化,延硅胶缓高pH值水解,杂化颗粒: Waters Xterra,表面碳杂化示意图,pH=12 条件下的稳定性,4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um,1h,200 h,总结:如何选择色谱柱和相应的色谱条件,了解目标化合物的性质:结构(官能团)、pKa、分子量、浓度范围、溶解度、极性 了解色谱柱的性质 粒径,孔径,比表面积 保留强度和柱效;抗污染性 基质表面特性,键合类型保留强度,选择性,柱效,对称性,灵敏度,稳定性和重现性 选择相应的色谱条件,色谱柱选择(),替代:粒径,比表面,基质表面特性,键合类型相似 新方法开发: 粒径:2um vs 3um vs 5um (分析时间,灵敏度,仪器,价格,寿命) 内径柱长:内径3mm vs 4.6 vs 7.8(对分离影响不大,成本);柱长与粒径相关 比表面:(低比表面耐污染,高比表面利于分离) 孔径:在满足比表面前提下大孔径较好 硅胶基质表面特性:)尽可能使用高纯硅胶;)尽可能使用低酸性硅胶;)当流动相尽可能使用表面杂化;)使用多硅羟基残留,可加强对于极性化合物保留或削弱对于非极性化合物保留 键合类型:取决于选择性和流动相要求;具有一定极性的()可以作为首选尝试;耐酸:选择;耐碱:Durashell 封尾与不封尾:封尾削弱硅羟基影响;不封尾:提高硅羟基影响,增强极性物质保留,降低柱流失。,乙腈水,乙腈水,乙腈水,KH2PO4 pH=4.2,

注意事项

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