{企业并购重组}第13章基因重组和基因工程

基因工程与基因体外表达 Genetic Engineering and gene expression in vitro,第13章,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子,1997年,动物克隆: 克隆羊多莉,1977年，基因工程产品的出现 H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS),1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验,2001年，人类基因组计划,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。,目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,重组DNA技术基本原理,基本原理,第一节 基因克隆是利用工具酶 进行操作,工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,GGATCC CCTAGG,G CCTAG,GATCC G,+,Bam H,定义：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,、（基因工程技术中常用型）,分类：,作用：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,属 系 株 序,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,II型限制性核酸内切酶： 能识别DNA分子内部的特异性位点和切割双链DNA， 其切割位点的序列可知、固定。,Bam H,GTC CAG,G CCTAG,GATCC G,+,GGATCC CCTAGG,Hind,GTCGAC CAGCTG,GAC CTG,+,平端切口,粘端切口,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,GGATCC CCTAGG,G CCTAG,GATCC G,+,Bam H,GGATCC CCTAGG,G CCTAG,GATCC G,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,GGATCC CCTAGG,AGATCT TCTAGA,G CCTAG,GATCC G,+,+,A TCTAG,GATCT A,同尾酶,限制性内切核酸酶,重组DNA技术中常用的工具酶,第二节基因克隆需要特定的载体,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准：,能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。,质粒 (plasmid),特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-23 kb), phage,12bp, 替换型载体（取代型载体）,外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段 ( 20 kb) 高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比质粒高100-倍),e.g. EMBL3, DASH,凯伦噬菌体载体 既有插入型；又有替换型 在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb,3. 粘性质粒(cosmid):适合克隆大的DNA片段,柯斯质粒载体的特点 具有噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb,整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。 游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。,4. 病毒载体,病毒载体,优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。,常用的病毒载体的特点：,酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,5. 其他,表达载体,指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为表达载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。,原核表达载体,在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等表达元件。,原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有： Lac(乳糖启动子)、 Trp(色氨酸启动子)、 Tac(乳糖和色氨酸的双启动子) 、 PL( 噬菌体的左向启动子)、 T7噬菌体启动子等。,真核表达载体至少要含两类序列： 原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。 在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,选用质粒（最常用）做载体的4点要求： 选分子量小的质粒，即小载体（11.5kb）不易损 坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10 个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指 多位Ampr。,第三节 基因克隆的过程,1、制备目的基因和相关载体 2、将目的基因和有关载体进行连接 3、将重组本DNA导入受体细胞 4、DNA重组体的筛选和鉴定 5、DNA重组体的扩增、表达和其他研究,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),一、目的基因序列的来源和分离,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,人工化学合成法使用于：,较短的基因（60-80bp） 用途： PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,限制酶切位点,cos L 左臂,R cos 右臂,真核生物染 色体DNA,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体 感染大肠杆菌,20 Kb DNA 片段,基因文库,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,cDNA文库 将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。,从cDNA文库获取目的基因,聚合酶链式反应（PCR） TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。 其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中 。,二、载体的选择与制备,噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，pUC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表达的，则要选择合适的表达载体。,三、重组体的连接,1、粘性末端的连接 2、利用人工接头连接 3、加入同聚物尾连接 4、平端连接,方式： (1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,粘性末端连接,