肝功能测定试剂盒方法
脂质氧化（MDA）检测原理：碧云天的脂质氧化（MDA）检测试剂盒（Lipid Peroxidation MDA Assay Kit）采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸（thiobarbituricacid,TBA）反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测。 丙二醛（Malondialdehyde,MDA）是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激（oxidative stress）时，会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其他生化反应也会产生MDA，例如thrmboxane合酶也可以催化产生，但只要在侧定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外，MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测。检测限1um200um。试剂和材料：产品编号产品名称包装S0131-1TBA25mgS0131-2TBA配制液6.76mlS0131-3TBA稀释液15mlS0131-4抗氧化剂300ulS0131-5标准品（1mM）200ul保存条件：-20保存，一年有效。TBA和抗氧化剂需避光保存。TBA、TBA配制液、TBA稀释液可室温或4存放三个月。实验方法样品预处理：a 血浆、血清或尿液样品制备后可以直接用于MDA测定b 组织或细胞可以使用PBS或碧云天的Western及IP细胞裂解液（P0013）等裂解液进行匀浆或裂解。对于组织，组织重量占匀浆组织或裂解液的比例为10%；对于细胞，每100万细胞使用0.1ml裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，10000-12000g离心10分钟取上清用于后续测定。对于一些特殊样品，离心不能获得澄清的上清液的，可以使用0.2um孔径的过滤器过滤以获得澄清的样品溶液。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4进行操作。c 对于组织或细胞样品，样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。试剂配制a TBA储存液的配制：称取适量TBA，用TBA配制液配制成浓度为0.37%的TBA储存液。TBA配制液需完全溶解后再使用，可以加热到70以促进溶解。TBA储存液较难溶解，需加热到70，并通过剧烈Vortex以促进溶解。配置好的TBA储存液室温避光保存，至少3个月内有效。b MDA检测工作液的配制：根据待测定的样品数（含对照），参考下表在临检测前新鲜配制适量的MDA检测工作液检测次数1次10次20次50次TBA稀释液150ul1500ul3000ul7500ulTBA储存液50ul500ul1000ul2500ul抗氧化剂3ul30ul60ul150il注意：MDA检测工作液较难溶解，可以70加热，并剧烈Vortex以促进溶解。也可以通过超神处理以促进溶解。配置好的MDA检测工作液必须当天使用。c 标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50uM用于后续制作标准曲线。如果样品中MDA的浓度很高，可以增加100、150和200uM的标准品浓度。样品测定：a. 在离心管内加入0.1ml匀浆液、裂解液或PBS等适当溶液作为空白对照，加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定；随后加入0.2mlMDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系：空白对照标准品样品匀浆液、裂解液或PBS0.1ml0.1ml待测样品0.1mlMDA检测工作液0.2ml0.2ml0.2mlb. 混匀后，100或沸水浴加热15分钟。加热时务必注意避免液体暴沸溅出。使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺1小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热 0.5mlPCR管的PCR仪。c. 水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟。取200ul上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。d. MDA含量的计算：对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，对于细胞或组织样品，计算出样品溶液中的MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如umol/mg蛋白或umol/mg组织。注意事项：醛、较高浓度的可溶性糖对反应有干扰，可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm）。如果可溶性糖对测定有干扰，可以通过测定450nm作为参考波长进行双波长测定，消除其干扰。GSH和GSSG检测原理GSH（还原型谷胱甘肽）；GSSG（氧化型谷胱甘肽）谷胱甘肽（glutathione）是一种由3个氨基酸残基组成的小肽，包括还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。还原型谷胱甘肽是绝大数活细胞硫基的主要来源，对于维持蛋白质中硫基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂。总谷胱甘肽中通常9095%为还原型谷胱甘肽。通过谷胱甘肽还原酶把GSSG还原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系，前后两个反应合并起来后，总谷胱甘肽（GSSG+GSH）就相当于一个颜色产生的限速因素，总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定A412就可以计算出总谷胱甘肽的量。用适当试剂先清除样品中的GSH，然后利用上述反应原理就可以测定出GSSG的含量。用总谷胱甘肽的量扣除GSSH的含量，就可以计算出GSH的含量。检测限本试剂盒的检测下限为0.5uM。一个试剂盒共可以进行100次检测，可以测定100个样品的总谷胱甘肽或GSSG的含量，或可以测定出50个样品中GSH和GSSG的各自含量。包装清单：产品编号产品名称包装S0053-1总谷胱甘肽检测缓冲液60mlS0053-2谷胱甘肽还原酶150ulS0053-3氧化型谷胱甘肽（GSSG）5mgS0053-4DTNB4.5mgS0053-5蛋白去除剂M1gS0053-6NADPH4mgS0053-7DMSO1.5mlS0053-8GSH清除辅助液2mlS0053-9GSH清除试剂500ul保存条件：-20保存，一年有效。GSSG配制成溶液后，需适当分装，-20保存至少3个月有效。DTNB溶解于DMSO后，需适当分装，-20保存至少3个月有效。蛋白去除剂M配制成溶液后仅限当天使用。NADPH溶解后，适当分装，-70保存。稀释的GSH清除辅助液和GSH清除试剂溶液均需新鲜配制使用。注意事项：所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定，提别是DTT、硫基乙醇等含硫基的试剂。NADPH等试剂不太稳定，要严格按照后续说明操作，谨防失活。蛋白去除剂M溶液必须新鲜配制并限当日使用。GSH清除试剂也需新鲜稀释后使用。蛋白去除试剂M较难溶解，可以通过剧烈vortex并适当加热（不超过37）以促进溶解。DMSO在4、冰浴等较低温度情况下会凝固，可以在20-25水浴温浴片刻至全部融解后使用。实验方法：试剂配制：a. GSSG储备液的配制：在本试剂盒提供的5mgGSSG中加入816ulMillii-Q级纯水，溶解并混匀，即为GSSG储备液，浓度为10mM。除立即待用部分外，其余GSSG储备液适当分装后-20保存。b. DTNB储备液的配制：在本试剂盒提供的4.5mgDTNB中加入1.5ml本试剂盒提供的DMSO，溶解并混匀，即为DTNB储备液。除立即待用部分外，其余DTNB储备液适当分装后-20保存。c. 蛋白去除试剂M溶液的配制：称取0.2g蛋白去除试剂M，加入4ml总谷胱甘肽检测缓冲液，配制成4ml 5%的水溶液。蛋白去除试剂M溶液必须新鲜配制并限当天使用。d. NADPH储备液（40mg/ml）的配制：在本试剂盒提供的4mgNADPH中加入100ulMilli-Q级纯水，溶解并混匀，即为NADPH储备液。除立即待用部分外，其余NADPH储备液适当分装后-70保存。e. 5倍稀释谷胱甘肽还原酶的配制：取50ul谷胱甘肽还原酶，加入200ul总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀，即成5倍稀释的谷胱甘肽还原酶。f. 总谷胱甘肽检测工作液的配制：根据待检测的样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液，表中三种试剂按比例混合后即为总谷胱甘肽检测工作液。1个样品10个样品20个样品5倍稀释谷胱甘肽还原酶6.6ul66ul132ulDTNB储备液6.6ul66ul132ul总谷胱甘肽检测缓冲液150ul1.5ml3mlg. 0.5mg/mlNADPH的配制：取10ulNADPH储备液，加入790ul总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀即为0.5mg/mlNADPH。每检测一个样品需50ul 0.5mg/mlNADPH。h. 稀释的GSH清除辅助液的配制：在47ulMilli-Q级纯水中加入53ulGSH清除辅助液，立即混匀。稀释后的GSH清除辅助液不太稳定，每次使用时均需新鲜配制，并仅限当日使用。i. GSH清除试剂工作液的配制：10.8ulGSH清除试剂中加入89.2ul无水乙醇，立即混匀。GSH清除剂工作液每次也需新鲜配制。标准品的制备:a. 把10mM GSSG储备液用蛋白去除试剂M溶液稀释成15uM GSSG溶液。然后依次稀释成10、5、2、1、0.5uM GSSG溶液。取15、10、5、2、1、0.5uM GSSG溶液六个点做标准曲线。注意：由于GSSG在蛋白去除试剂M溶液中不太稳定，用蛋白去除试剂M溶液配制的GSSG溶液必须新鲜配制使用，不可冻存后再使用。b. 如果需要测定样品中GSSG含量，按照每100ul标准品加入20ul稀释的GSH清除辅助液的比例加入稀释的GSH清除辅助液，立即vortex混匀。然后按照每100ul加入4ulGSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除试剂工作液，立即vortex混匀，25反应60分钟。即可用于后续的GSSG含量检测。待测总谷胱甘肽含量样品和标准品的准备：组织样品的准备：取组织用液氮速冻，然后研成粉末。每10mg研碎的组织粉末，加入30ul蛋白去除试剂M溶液，充分vortex。再加入70ul蛋白去除试剂M溶液，用玻璃匀浆器充分匀浆。4放置10分钟后，10000g 4离心10分钟，取上清用于总谷胱甘肽的测定。样品需暂时4保存，不立即测定的样品可以-70保存，但不宜超过10天。对于处理好的组织样品通常需用蛋白去除试剂M溶液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数通常是5-20倍。待测GSSG含量样品的准备：取部分上述准备好的待测总谷胱甘肽含量的样品，按照每100ul样品加入20ul稀释的GSH清除辅助液的比例加入稀释的GSH清除辅助液，立即vortex混匀。再按照每100ul样品加入4ulGSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除工作液，立即vortex混匀。25反应60分钟。通过上述反应可以清除高达50uM的GSH，如
