Southern Blot操作步骤及方法

Southern Blot操作步骤试剂的配置：Southern：0.25 mol/L HClSouthern：0.5 mol/L NaOHSouthern：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaClSouthern：1mol/L Tris-HCl，3 mol/L NaCl，用浓盐酸将pH调至6.520SSC： 3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸钠，用浓盐酸将pH调至7.0冷洗液：2SSC，0.1%SDS热洗液：0.1SSC，0.1%SDS马来酸缓冲液：0.1 mol/L Maleic acid，0.15 mol/L NaCl，用NaOH将pH调至7.5洗涤缓冲液：向马来酸缓冲液中加入0.3%（V/V）的Tween 20（20）检测缓冲液：0. 1mol/L Tris-HCl ，0.1mol/L NaCl，用浓盐酸将pH调至pH=9.5（20）Southern试剂盒：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit （Roche） 1号管：DIG-High prime（每2 L分装，保存于-20）地高辛标记探针的制备：以烟草总DNA为模板，用探针特异性引物进行PCR扩增，胶回收PCR产物（注意回收的浓度至少在70ng/L以上）。取回收的PCR产物约0.5-1 g，补加ddH2O至8 L；然后沸水浴10min，立即转入冰水混合物中；再将其转入分装有2 L DIG-High prime的PCR管中，混匀，微离心，37温浴10-20h；65加热10min终止反应，并保存于-20冰箱待用。4号管： Anti-Digoxigenin-AP Conjugate（能结合地高辛的抗体，其上耦联有碱性磷酸酶，该酶能催化底物【五号管】变为蓝色） 取出4号管后，4，10000g离心5min，分装，并保存在4冰箱。5号管：NBT/BCIP（底物）（保存于-20）6号管： 10Blocking Solution （保存于-20）（即10封闭液） 使用前用马来酸缓冲液将其稀释到1 7号管： DIG Easy Hyb（保存于-20）向其中分两次加入64mL ddH2O，在37中摇匀 实验操作如下：1.提取植物总DNA；2.选择合适的限制性内切酶酶切过夜；3.1%的琼脂糖凝胶电泳；先用30V让样品跑出上样孔，再用50V继续跑，直至溴酚蓝跑至凝胶底部；4.洗胶用Southern洗15min，至溴酚蓝完全变成黄色，洗完后快速用去离子水冲洗；（脱嘌呤）用Southern洗30min，至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色，洗完后快速用去离子水冲洗；（使DNA变性）用Southern洗30min，洗完后快速用去离子水冲洗；Southern洗15min；（中和残留的碱，使DNA析出以便转膜）5.转膜将尼龙膜切成11.612cm大小，快速在去离子水中浸湿，然后在20SSC中浸泡15min。另准备6张11.612cm大小的滤纸，一叠同样大小的吸水纸，及一张长条状滤纸。按如下所示顺序摆放：注意盐桥与胶，胶与尼龙膜及尼龙膜与滤纸之间不要有气泡，凝胶四周放上Parafilm（膜），防止短路转膜12h以上。6.紫外交联转膜结束后拿出尼龙膜（注意标明尼龙膜的正反面，正面为有DNA的一面），待其干后再置于杂交仪中，紫外杂交0.5min。交联完成后的膜可以在4中保存。7.预杂交42水浴预热杂交液（由7号管配置），再取预杂交液10mL加到杂交管中，注意尽量不要起泡； 将交联后的膜反面贴壁放入杂交管中，拧好管口防止漏液；将杂交管置于杂交仪中42杂交12-24h；8. 杂交新配置的杂交液：将探针沸水浴5min后立即转入冰浴，微离心，用枪将探针加到10mL预杂交液中（探针不要碰到膜，小心混匀，不要起泡）即为杂交液；将杂交管放回42的杂交仪中，杂交10-12h；已使用过的杂交液：杂交液可以储藏在-15到-25，可以反复使用几次，每次使用前需要提前68重新变性10分钟，随后放置于42水浴；9. 洗膜 在摇床上将膜用冷洗液洗两次，每次洗5min；将热洗液提前预热至68，在68水浴锅中用热洗液洗膜两次，每次洗15min； 再用洗涤缓冲液洗2min；最后用马来酸缓冲液泡3min；10.封阻加抗体取20mL 1Blocking Solution（6号管稀释）于杂交管中，再将膜反面贴壁放入杂交管中，常温（25），在杂交仪中封闭1h;向杂交管中加入1L抗体，杂交仪中常温杂交30min;11.洗抗体取出尼龙膜，在脱色摇床上用洗涤缓冲液洗三次，每次15min；洗完后再将膜在检测缓冲液中浸泡2min;12.加底物取100L底物（即5号管）用检测缓冲稀释至5mL并加入到大培养皿中，将膜也放入培养皿中，暗处理过夜。