恒温实时荧光法检测金黄色葡萄球菌

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.9 2262 恒温实时荧光法检测金黄色葡萄球菌 刘羽霏 1， 叶蕾 2，孟赫诚 3，闫鹤 3， 石磊 3 (1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642)(2.广州迪澳生物科技有限公司，广东广州 510663) (3.华南理工大学轻工与食品学院 ,广东广州 5106403) 摘 要： 恒温实时荧光技术是目前最新颖的核酸扩增方法。本文创建了恒温实时荧光法快速检测微生物技术方法并应用于金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus ) 的快速检测。本研究针对金葡菌特异序列 nuc 设计 6条引物，选取常见病原菌标准株为对照品进行引 物特异性检测；选取金葡菌标准菌株进行灵敏度检测；并且利用食品中分离的金葡菌，同时进行 LAMP 反应和荧光 PCR 实验，验证 LAMP 反应的检出率，结合 ESEQuant tube scanner 进行实时检测。结果显示：所建立的恒温荧光扩增法具有扩增效率高、特异性强、灵敏度高（灵敏度为 102 CFU/mL）等优点。对 50食品中分离的金葡菌进行检测，恒温荧光法检测出 50株，荧光 PCR的方法检测出 50 株，两种方法的检出率都为 100%。本文引入的 ESE Quant tube scanner 平台结合恒温实时荧光法检测金葡菌不 仅操作简单，便于携带，同时实现检测过程的数据化及自动化，适合金葡菌的现场检测和大规模监控。 关键词： 金黄色葡萄球菌 ；环介导等温扩增 文章 篇号： 1673-9078(2013)9-2262-2266 Detection of Staphyloccocus aureus by Real Time Fluorescence Isothermal Amplicication LIU Yu-fei1, YE Lei2, MENG He-cheng3, YAN He3, SHI Lei3 (1.South China Agriculture University, GuangZhou 510642, China) (2.GuangZhou Deaou Biotechnology CO,. LTD, GuangZhou 510663, China) (3.South China University of Technology, GuangZhou 5106403, China) Abstract: Isothermal real-time fluorescence technology is one of the most novel nucleic acid amplification method. 6 primers targeting the nuc gene of Staphyloccocus aureus was applied to detect S. aureus with ESEQuant tube scanner; Specificity of the primers was examined using stander strains of S. aureusand non-S. aureusstrains.S. aureus isolated from food was detected by LAMP based assay and by real time PCR. The results showed that the real time fluorescence isothermal amplicication had good efficiency, high specificity and high sensitivity (102 CFU/mL). 50 Staphyloccocus aureus strains isolated from food samples were selected for stability tests. 50 strains was detected as Staphyloccocus aureuswith LAMP and 50 strains were identified with real time PCR. The results in this study suggested that the ESE tube scanner platform has great potential as a field usable molecular tool for diagnosis of Staphyloccocus aureus. In addition, it provide an alternative diagnostic methods for field set, and for detection in developing area. Key words: Staphyloccocus aureus; Loop mediated isothermal amplificatoin 金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus)是人类的一种重要的病原菌，常存在于奶、肉、蛋、鱼、虾及其制品等食品中，人通过食用这类被金黄色葡萄球菌污染的食品而引发感染，在临床上表现为腹泻或呕吐等中毒症状；同时金葡菌也是医院临床感染导致肺炎及伤口感染的主要病原菌，占医院感染病例的 10%， 收稿日期： 2013-06-13 基金项目： 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 ( 2012ZZ0083)；国家自然科学基金青年科学基金项目（ 31201363）；广州市科技计划项目（ 11C12080718） 通讯作者：石磊（ 1961-），男，教授 ， 博导，研究方向为食品安全及微生物快速检测 因此找到一种简单、快速、经济的金葡菌检测方法 成为当前研究的热点问题之一 1。 目前，我国常规检测方法有生化培养鉴定，包括：血浆凝固酶试验、免疫学实验、耐热核酸酶活性试验及各种糖、醇发酵实验及新生霉素敏感实验等，其优点是操作简便，所需设备简单，但一般都存在耗时长、灵敏性差等缺点 23。随着分子生物学技术的快速发展和广泛应用，对金葡菌的检测方法也从传统生化培养方法转移到以 PCR、杂交探针、基因芯片等为主的现代分子生物学技术手 段 45。 PCR检测技术是在 DNA聚合酶、引物以及模板 DNA/RNA存在的情况下对离体核酸进行扩增的一种方法，其主要是针对特异性靶现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.9 2263 序列的检测。通过 PCR技术可以简便快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量的特定核酸，具有很高的灵敏度和特异性。目前，国内外许多临床机构已经将 PCR技术应用于金葡菌的快速检测 1。但是PCR检测技术所需仪器昂贵，大大提高了检测成本。PCR 法的检测需要依托 PCR 仪进行，对于基层单位而言，目前 PCR仪的售价相对较高，因此研究开发一种不倚赖贵重仪器、快速而准确的分子检测方法 ，是非常有必要的。 环介导恒温扩增技术 （ loop-mediated isothermal amplification， LAMP） 为新一代快速检测方法。该方法主要是利用 4条特异性引物识别靶基因上的 6个特定区域和具有链置换活性的 DNA聚合酶，在恒温条件进行扩增反应，扩增效率可达 1081010拷贝，反应扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的双链 DNA片段混合物 6。 本研究结合 ESEQuant Tube Scanner仪器将LAMP技术应用于金黄色葡萄球菌的检测，避免使用价格高昂的 PCR仪，为金葡菌的诊断提供一种快速、准确、简单、经济的方法。 1 材料和方法 1.1 标准菌株 单核增生李斯特氏菌 ATCC19115/413，沙门氏菌ATCC14028，金黄色葡萄球菌 ATCC6538，大肠杆菌O157ATCC43889，阪崎肠杆菌 ATCC29544，绿脓杆菌 ATCC9027，大肠杆菌 ATCC25922，大肠杆菌CMCC44102，阪崎肠杆菌 ATCC12868，副溶血性弧菌 ATCC17802，创伤弧菌 ATCC27562，金黄色葡萄球菌 CMCC26003，鲍氏志贺氏菌 CMCC51346，宋 内氏志贺氏菌 NICP51334，普通变形杆菌 NICPB490059，奇异变形杆菌 HB7131，克雷伯氏菌 CMCC(B)46117，藤黄微球菌 CMCC28001。 1.2 野生菌株 本实验室从食品（海鲜，禽肉，即食食品等）中分离的金黄色葡萄球菌，实验室保存。上述菌株菌菌保藏于脑心血（ BHI）琼脂培养基中。 1.3 主要试剂和仪器 超纯水， Bst DNA聚合酶大片段（购自 New England BIoLabs)， LA Taq酶（购自 TakaRa）恒温摇床，三角瓶，金属浴，移液器，离心机，超净工作台，ESEQant Tube Scanner，实时荧光 PCR仪（ Applied Biosystems 7500）等。 1.4 实验方法 1.4.1 DNA 模板的制备 将金葡菌接种入含有 7%氯化钠肉汤后放入35 培养箱过夜培养。 DNA模板的制取参照 SNT 2754.1-2011。取过夜培养的细菌纯培养物 1 mL， 1,2000 r/min离心 5 min，加入 1 mL生理盐水，洗涤沉淀， 1,2000 r/min离心 5 min，加入 100 µL超纯水，充分悬浮菌液，于 100 煮沸 10 min，于 1,2000 r/min离心 5 min，立即冰浴 2 min，取上清储存于 -20 作为 DNA模板备用。 1.4.2 引物设计与合成 针对金葡菌的特异性基因 nuc，应用 Primer Explorer V4 software (Eiken Chemical; http:/primer explorer. jp/ elamp4.0.0/index.html)软件设计 LAMP引物，设计好的引物序列利用 NCBI 网站进行序列特异性的比对（ Blast），引物序列如表 1，引物序列由 上海生工生物工程有限公司合成。 1.4.3 引物的检测 通过软件根据设计的引物，通过 ESEQant Tube Scanner进行 LAMP实验，观察出峰的时间及假阳性的出现情况。 表 1 LAMP 的反应体系 Table 1 Reaction system of LAMP 反应液 (2×) 12.5 µL Bst DNA 聚合酶大片段 (8 U/µL) 1.0 µL 外引物 F3 0.2 µmol/L（终浓度） 外引物 B3 0.2 µmol/L（终浓度） 内引物 FIP 1.6 µmol/L（终浓度） 内引物 BIP 1.6 µmol/L（终浓度） 环引物 LoopF 0.8 µmol/L（终浓度） 环引物 LoopB 0.8 µmol/L（终浓度） 染料 0.5 µL DNA 2.0 µL 超纯水 8.0 µL 总计 25.0 µL 1.4.4 LMAP 反应条件 参照 DNA扩增试剂盒（恒温扩增法 SR01-24，广州迪澳生物科技有限公司） 说明书的要求进行 LAMP反应，反应过程在 ESEQant Tube Scanner中进行，反应温度为 63 ，反应时间为 45 min。每次检验分别设置灭菌双蒸水为阴性对照 。荧光通道选择 FAM。 1.4.5 特异性实验 选取常见的病原菌的标准株为对照品 （见表 3） ，现代食品科技 Modern Food Science