第八章 细胞凋亡
概述细胞凋亡过程与机制细胞凋亡与疾病细胞凋亡的检测 第八章细胞凋亡 概述 一 细胞死亡的模式 Necrosis 细胞病理性死亡 Apoptosis 细胞自发性死亡 坏死 凋亡 apoptosis Conceptofapoptosis 体内外生理或病理因素触发细胞内死亡程序 细胞死亡 细胞坏死与细胞凋亡的区别 细胞凋亡与细胞坏死的区别特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激受累范围单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减小 固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理死亡方式病理死亡方式 凋亡的生理学意义 胚胎发育期去除某些细胞 维持内环境稳定增殖细胞群中细胞去除 去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞 参与防御反应细胞毒T细胞凋亡过多或不足 疾病 肿瘤 艾滋病 神经变性性疾病 缺血性损伤 二 凋亡时细胞的主要变化 1 形态学改变 Themorphologiccharacteristicsofapoptosis 凋亡细胞 实体细胞 与周围细胞脱接触胞膜空泡化 Blebbing 细胞固缩 Condensation 核固缩和发芽凋亡小体 Apoptoticsmallbody 细胞凋亡 扫描电镜 正常细胞 扫描电镜 透射电镜 凋亡细胞 凋亡小体 DNA片断化 caspase激活 灭活凋亡抑制物 水解活性蛋白 水解结构蛋白 Ca2 Mg2 Zn2 2 生化改变 Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis 钙超载 DNA片段化 DNAladdingpattern 核酸内切酶激活核小体连接区DNA降解180 200bp整数倍的DNA片段 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 凋亡的过程及机制 凋亡诱导因素 死亡信号 巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞 凋亡的机制 细胞凋亡的两条通路 死亡受体途径 线粒体途径 1 死亡受体途径 deathreceptorpathway 死亡受体 deathreceptor DR 肿瘤坏死因子受体超家族成员 跨膜蛋白 与相应配体结合传递细胞信号Fas CD95 TNFR1 RAIL R2 DR5 参与死亡受体信号转导的接头蛋白 死亡结构域蛋白 deathdomainprotein DD TRADD TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF TNFR1 死亡结构域 TRADD 细胞凋亡FADD Fas相关死亡结构域蛋白FasL Fas 死亡结构域 FADD 细胞凋亡 FasL Fas凋亡诱导复合物 DISC FADD C端DD结构域与Fas胞内段结合N端DED结构域与无活性caspase8酶原交联 caspase8酶原聚集到复合物上一系列caspase激活细胞凋亡 FADD Fas associateddeathdomain DD deathdomain DED deatheffectordomain FSAL FADD Pro caspase 8 Caspase 8 Caspase 3 Pro caspase 3 Fas DED DED DD 2 线粒体途径 线粒体释放细胞色素C 细胞凋亡PT孔开放 线粒体跨膜电位 细胞色素C释放促凋亡蛋白Bax促PT孔开放抗凋亡蛋白Bcl 2 Bcl xl抑制PT孔开放 细胞色素C Apaf 1 caspase9前体 凋亡体召集并激活caspase3 细胞凋亡Apaf 1 凋亡蛋白酶活化因子 线粒体途径 mitochondrialpathway Caspase依赖的细胞凋亡 Caspase dependentapoptosis Caspase特点 以酶原的形式存在 酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性 水解天冬氨酸C端肽键故称Caspases Cysteine asparticacid protease Caspase家族的分类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶 Caspase8 Caspase9 Caspase10凋亡效应亚类Caspase蛋白酶 Caspase3 Caspase6 Caspase7ICE interlukin 1 convertingenzyme 亚类Caspase蛋白酶 参与炎症反应Caspase1 Caspase4 Caspase5 Caspase11 Caspase12 Caspase13 Caspase14 Caspase通路分类 启动亚类 Caspase 8 9 10 效应亚类 Caspase 3 6 7 Caspase 死亡受体途径线粒体途径 Caspase可激活CAD caspase activatedDNase 核酸酶 该酶在核小体的连接区将DNA切断 形成约200bp整倍数的核酸片段正常情况下 CAD与抑制物ICAD DFF 45结合 存在于胞质中 无活性Caspase活化后降解抑制物ICAD CAD激活并入核降解DNA使其片段化 Pro caspase 9 caspase 9 Effectorcaspase Caspase 3 Pro caspase 3 Caspase的作用 Caspase非依赖的细胞凋亡 Caspase independentapoptosis 凋亡诱导因子 AIF 线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因子结合 从而促发凋亡 钙超载 钙超载引起凋亡机制 胞浆 Ca2 激活核转录因子 加速凋亡相关基因的转录 激活Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 降解DNA链 激活谷氨酰胺转移酶 使细胞骨架分解 凋亡小体 细胞凋亡 细胞凋亡的调控 凋亡相关因素凋亡信号的转导凋亡相关基因 1 影响细胞凋亡的因素 2 凋亡信号转导的特点 多样性 不同种类细胞有不同的信号转导系统 偶联性 死亡信号转导系统与细胞增殖 分化过程中的信号转导系统在一些环节上交叉 偶联 同一性 不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统引起细胞凋亡 多途性 同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触发细胞凋亡 3 细胞凋亡的调控基因 Regulatedmechanismofapoptosis Bcl 2基因 Bcelllymphoma leukemia 2 广泛存在于造血细胞 上皮细胞 淋巴细胞 神经细胞及多种瘤细胞Bcl 2家族已发现15个成员 可分为3个亚族 Bcl 2亚家族 抑制细胞凋亡Bax亚家族 促进细胞凋亡BH3亚家族 促进细胞凋亡 Bcl 2抑制凋亡机制 抑制线粒体PT孔开放 Cyt c AIF释放 结合和灭活Apaf 1 阻断caspase 9活化 特异性结合细胞色素C 维持细胞钙稳态 c myc bcl x 促进增殖c myc 转录调节因子 诱导凋亡Bcl XL 抑制凋亡Bcl xBcl Xs 促进凋亡 GF p53促凋亡机制 与Bcl 2基因相互作用 下调Bcl 2的表达 诱导线粒体内凋亡的相关蛋白 Bax等 表达 并触发细胞色素C释放和caspase活化 诱导死亡受体Fas表达 C myc双向调控凋亡 调控细胞周期基因 编码的蛋白是DNA结合蛋白 调控基因转录 GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因GF不足时激活凋亡基因 凋亡与疾病 Diseasesassociatedtoapoptosis 一 细胞凋亡不足 Apoptosisinhibition 1 肿瘤 Tumor bcl 2基因过表达85 滤泡状和20 弥漫性B细胞淋巴瘤染色体t 14 18 易位IgH基因与bcl 2基因拼接bcl 2基因活化细胞凋亡速率 肿瘤发生 乳腺癌 肝癌 膀胱癌 肺癌 胶质瘤等也存在Bcl 2高表达 p53基因缺失或突变p53的稳定性 细胞内定位或 和 活性异常p53表达或功能缺陷细胞凋亡率 肿瘤发生 病毒的癌基因HBV编码的HBX是Caspase 3的强效抑制物 与肝癌发生密切相关 异常融合蛋白慢性髓细胞性白血病 CML 染色体易位t 9 22 Bcr abl融合基因 p210Bcr abl蛋白质 NF B活化 细胞凋亡速率 髓系祖细胞的克隆扩增肿瘤发生 2 自身免疫病 Autoimmunediseases 针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除 机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫 导致器官组织损伤 二 细胞凋亡过度 Apoptosisexcess 1 心肌缺血与缺血 再灌注损伤 特点 缺血早期以凋亡为主 晚期以细胞坏死为主 在梗死灶的中心以坏死为主 梗死灶周边以凋亡为主 轻度缺血以凋亡为主 重度缺血以坏死为主 机制 氧化应激 Fas通路 p53基因转录增加 细胞凋亡在疾病防治中的意义 合理利用凋亡相关因素1 诱导靶细胞凋亡放疗 化疗高热 高温2 减少细胞凋亡 NGF 促生长因子 抗氧化剂 抑制Bcl 2抗凋亡作用促进促凋亡基因作用增强P53促凋亡作用 干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降 细胞凋亡的检测 1 细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测2 磷脂酰丝氨酸外翻分析 AnnexinV法 3 线粒体膜势能 mt 的检测4 DNA片断化检测5 TUNEL法6 Caspase 3活性的检测7 凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析 1 细胞凋亡的形态学检测 光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞 凋亡细胞V变小 变形 细胞膜完整但出现发泡现象 晚期可见凋亡小体 染色细胞 常用姬姆萨染色 瑞氏染色 苏木精染色等 凋亡细胞的染色质浓缩 边缘化 呈新月状附在核膜周围 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况 常用的DNA特异性染料有 HO Hoechst33342 HO Hoechst33258 DAPI 电子显微镜观察 NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess 488nm 400 电镜观察凋亡细胞体积变小 胞质浓缩 凋亡 期的细胞核内染色质高度盘绕 出现许多空泡结构 IIa染色质高度凝集 边缘化 凋亡晚期 细胞核裂解为碎块 产生凋亡小体 流式细胞术检测 2 磷脂酰丝氨酸外翻分析 AnnexinV法 Phosphatidylserine PS 正常位于细胞膜的内侧 在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面Annexin V Ca2 依赖性磷脂结合蛋白 能与PS高亲和力特异性结合 将Annexin V进行荧光素 FITC R PE 标记后作为探针 利用流式细胞仪 荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生 2 磷脂酰丝氨酸外翻分析 AnnexinV法 ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC AnnexinV PI 3 线粒体膜势能 mt 的检测 线粒体荧光染料 Rhodamine123 DiOC6 3 JC 1 TMRM等对线粒体膜电位非常敏感 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低 4 DNA片段化分析 细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂 形成180 200bp整数倍的寡核苷酸片段 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱 DNAladder 5 TUNEL法 6 Caspase活性检测 7 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析凋亡早期TFAR19表达 并出现快速核转位现象 伴随着细胞核形态学的变化 持续较长时间 在凋亡小体中仍然可见 利用荧光素 FITC 标记的TFAR19单克隆抗体为探针进行TFAR19蛋白的细胞定位分析 DoublestaininganalysisofnuclearlocalizationofTFAR19inK562andHeLacellstreatedwithVP16
