活性氧在慢性间歇性低压低氧适应性心脏保护形成中的作用和机制

河北医科大学，。- J U b l l ，、丁 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应法律责任。 研究生签名： 导师签孰 蜀慧确髯 二级学院领导盖章： 劢乜年岁月7 日 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生签名：马慧稿 导师签章： 过雩 目录 _fII|!IfI|f|!|ffIIff川JII Y 2 10 5 2 15 中文摘要1 英文摘要6 英文缩写12 研究论文活性氧在慢性间歇性低压低氧适应性心脏保护形成中的作用 和机制 引言1 3 第一部分活性氧参与清醒大鼠慢性间歇性低压低氧适应过程中心血管 活动的动态变化 前言1 4日U 舌1 4 材料与方法15 结果2 0 附图2 3 附表3O 讨 仑3l 小结3 4 参考文献3 4 第二部分活性氧激活的N r f 2 嗽1 m F l 信号途径参与大鼠慢性间歇性 低压低氧适应性心脏保护的形成 前言4 0月U 舌4 【) 材料与方法4 2 结果4 4 附图4 7 讨 仑6 4 小结6 7 参考文献6 7 第三部分慢性间歇性低压低氧通过适应过程中产生的R O S 易化颈动脉 体化学感受器活动 前言7 4月l j 吾7 4 材料与方法7 5 结果8 0 附图8 3 讨论8 9 小结9 1 参考文献9 2 结论9 6 综述慢性低氧适应的心脏保护机制9 7 致谢1 12 个人简历1 1 3 中文摘要 活性氧在慢性间歇性低压低氧适应性心脏保护形成中的作用和 机制 摘要 近年来，慢性间歇性低压低氧( c h r o n i ci n t e m l i t t e n th y p o b a r i ch y p o x i a ， C I 姗) 对心脏的保护作用及其机制的研究越来越引起人们的关注，已成 为临床医学、航天医学和高原医学等领域的研究热点之一。C I 唧的心脏 保护作用主要包括抗缺血性损伤，抗心律失常和改善心肌退行性变三个方 面。其作用机制可能与促进心肌毛细血管增生、增加冠脉血流量、激活 A T P 敏感性钾通道、抑制线粒体通透转换孔以及抑制心肌细胞膜肾上腺素 能受体活性等因素有关。然而，这些研究均是针对C I 删处理后结果，即 C I 瑚处理的最终效应所进行的。然而，有关C I 删适应性心脏保护作用 的形成过程及机制尚未见报道。目前一致的观点认为，活性氧( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，R o S ) 具有保护性或损伤性双重作用，取决于R O S 的数 量。大量证据表明，R O S 在低浓度时表现心脏保护作用，而高浓度时可 导致心肌损伤作用。在培养的细胞或者整体动物水平，间歇性低氧均可刺 激R O S 产生，R O S 可以通过介导信号转导机制而参与细胞和机体对间歇 性低氧的适应性反应。已有研究证实核转录因子2 一硫氧还蛋白1 一低氧 诱导因子1 ( N r f 2 讯1 m F 1C L ) 信号途径介导由R O S 诱导的间歇性低氧 反应。但迄今为止，尚不清楚R O S 是否参与C I 删适应性心脏保护的形 成。 本研究旨在利用功能学、药物学、形态学和分子生物学等方法，在清 醒动物整体、离体心脏和细胞分子水平动态观测C I 唧适应性心脏保护的 产生过程，并探讨R O S 在其中的作用及其信号转导机制。研究分为以下 三个部分：( 1 ) 利用生理信号遥测系统在清醒大鼠，动态观测C I 删适应 形成过程中心血管活动的变化，并明确R O S 在其中的作用。( 2 ) 证实 N r f 2 风1 H I F l0 【分子途径及其主要的下游信号分子参与C I 删适应性心 脏保护的形成，以及R O S 在其中的作用。( 3 ) 明确C I 删对劲动脉体化 学感受器敏感性的影响及R O S 在其中的作用。 中文摘要 I 活性氧参与清醒大鼠慢性间歇性低压低氧适应过程中心血管活动的 动态变化 目的：C I 具有心脏保护作用。大量证据表明低氧刺激产生的R O S 可作为第二信使激发机体产生各种适应性反应。本研究旨在探讨C I 删适 应过程中心血管活动的动态变化，以及I 的S 所起的作用。 方法：雄性S D 大鼠随机分为四组：对照组( C o n 仃0 1 ) 、间歇性低压 低氧处理组( C I 瑚) 、抗氧化剂N 一乙酰半胱氨酸处理组( C o n t r o l + N A C ) 和应用N 一乙酰半胱氨酸同时间歇性低压低氧处理组( C I 唧+ N A C ) 。 C I 删组大鼠置于低压氧舱，给予4 2 天模拟海拔5 0 0 0 米的低压低氧处理， 每天6 小时，其余时间处于常氧环境。C o n t r o l + N A C 组大鼠每天同一时间 皮下注射N A C ( 8 0m 鲫( g ) 。C I 删十N A C 组大鼠每天上仓前皮下注射N A C 。 C o n t r o l 组动物除不接受C I 矾及N A C 处理外，其余处理与C I 大鼠相 同。利用清醒动物生理信号遥测系统监测和分析大鼠在相应处理过程中平 均动脉压( M A P ) 和心率( 腿) 的变化。应用E L I S A 方法测定左心室心 肌组织中总超氧化物歧化酶( S O D ) 、过氧化氢酶( C A T ) 、谷胱甘肽过氧 化酶( G P X ) 、丙二醛( M D A ) 、类脂褐素( L F P ) 、蛋白羰基( P C L ) 和谷胱甘 肽二硫化谷胱甘肽的比值( G S H G S S G ) 以监测心肌的氧化应激水平。 结果： ( 1 ) C I 硼大鼠心肌组织G S H P X ，M D A 和L F P 增加，G S H G S S G 降低( P < O 0 5 ) ，说明C I 唧可提高心肌氧化应激水平和I 的S 的产生。 ( 2 ) C I 肌不影响常氧状态下各组动物的M A P 。但可以取消腿随 年龄的降低( P < O 0 5 ) ，N A C 处理可部分阻断C I 删( P < O 0 5 ) 这一作用。 ( 3 ) 在低压低氧仓内，C I 唧大鼠的M A P 和腿出现适应性变化。 早期( 上仓1 小时内) M A P 和腿迅速升高达到峰值( P < O 0 5 ) ，而后逐 渐降至最低。后期( 上仓2 至6 小时内) ，M A P 和腿相对稳定，呈平台 水平。随C I 瑚处理时间的延长，M A P 和峰值和平台值逐渐升高，达峰 值的时间缩短( P < O 0 5 ) 。腿的峰值逐渐降低，达峰值时间延长，而其平 台值逐渐升高( P < O 0 5 ) 。N A C 处理可部分取消M A P 和脉的适应性变 化。 ( 4 ) 给予急性常压低氧刺激，C I 删大鼠的脚和腿升高幅度明 显低于C o n t r o l 和C o n t r o l + N A C 组动物( P < O 0 5 ) 。C I 唧的这种抗低氧损 中文摘要 伤作用至少可持续两周。N A C 处理可部分阻断C I 瑚的此种作用 ( P < 0 0 5 ) 。 结论：本研究首次在清醒大鼠证实，C I 删过程产生的适量R O S 参 与C I 肌过程中脚和职的适应性变化，并参与形成对抗急性低氧损 伤的适应性保护机制。这种R O S 依赖的适应性保护作用产生至少需要2 8 天的C I 唧所激发；而且在C I 删处理结束后，这种保护作用可持续至少 两周。 I I 活性氧激活的N r f 2 T r x l H I F l 信号途径参与大鼠慢性间歇性低压低氧 适应性心脏保护的形成 目的：探讨C I 唧适应形成过程中N r 亿隐1 F 1 信号途径及其主要 下游分子的激活，以及R O S 在其中的作用。 方法：实验分组和C I 处理同本研究第一部分。利用W 色s t e m 印迹 和免疫组织化学的方法观测左心室心肌组织中N r f 2 ，m 1 ， F 10 【，i N O S ， V E G Fa n dE P O 的表达。 结果： ( 1 ) C I 删过程中N r 也T 1 F 1 信号途径被激活。C I 唧处理2 8 天后，N r 亿，弧l ，m F l Q 表达明显增强( P < O 0 5 ) 。C I 删大鼠左心室心肌 组织中，N r f 2 的核转位及N r f 2 阳性细胞核数均明显增加( P < 0 0 5 ) 。N A C 处理可部分阻断这些效应( P < O 0 5 ) 。 ( 2 ) R O S 可诱导N r 亿的核转位，即N r 晓的激活。C I 删处理l 天 后，心肌细胞核中N r 亿的表达明显升高，阳性细胞核数增加( P < O 0 5 ) 。 应用N A C 抑制了N r f 2 的表达( P < O 0 5 ) ，N r 晓的激活推迟至C I 删处理 2 天以后。 ( 3 ) R O S 介导C I 删过程中N r f 2 孤1 H I F l 信号途径的激活。在心 肌的全细胞提取物中，N r 亿在C I 瑚处理的2 天后被激活( P < O 0 5 ) ，T 1 和m F l 在C I 删处理3 天后被激活( P < O 0 5 ) 。应用N A C 抑制这些信号 分子的表达，并将N r f 2 、T l 和m F l 信号分子激活时间分别推迟至C I 删 处理后3 天或5 天。 ( 4 )