海洋来源化合物ycua6、yc72、gc29抗h5n1高致病流感病毒机理的研究

河北医科大学 硕士学位论文 海洋来源化合物YCUA-6、YC-72、GC-29抗H5N1高致病流感病毒 机理的研究 姓名：杨森 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：雷志勇;陈虹 20090301 中文摘要 海洋来源化合物Y C U A 一6 、Y C 7 2 、G C 2 9 抗H 5 N 1 高致病流感病毒机制的研究 摘要 高致病性流感是一种急性传染病，引起该疾病的为 H 5 N 1 高致病性流感病毒。该病毒的天然宿主源于野生禽类， 不表现出明显症状，但却可以导致大量家禽死亡，造成巨大 的经济损失。自1 9 9 7 年中国香港首次证实了H 5 N 1 高致病 流感病毒感染人类的病例，该病毒具备了跨越种属障碍感染 人类的能力，幸运的是，尚不能造成人与人之间的传播。目 前的数据显示，该病毒的传播范围在不断扩大，感染人数在 不断上升，未来大范围的爆发高致病性流感的可能性越来越 大。 高致病流感病毒目前尚无特效治疗方法。疫苗被认为是 最有效的途径，临床上针对H 5 N 1 高致病人流感的疫苗正 在研制过程中，但实际上疫苗的应用具有滞后性和易变性等 缺点，故尚未有理想的人用的高致病流感疫苗问世。药物治 疗使用的神经氨酸酶抑制剂和M 2 离子通道阻断剂存在一 定的副作用，并且临床上已经出现耐药病毒株。因此，采 用新的实验技术寻找新颖的作用靶点成为研发抗病毒新药 的重点。 流感病毒侵入细胞作为病毒感染宿主的第一步，同时也 是研究抗流感病毒药物的重要环节。血凝素蛋白( H A ) 在 流感病毒侵入宿主细胞过程中起关键作用：成熟的H A 由 H A l 和H A 2 两个亚基组成，其功能分别为识别并结合宿主 中文摘要 细胞表面受体唾液酸( S A ) 及介导膜融合过程。作为一个新 靶点，目前尚未有以H A 为靶点的药物，所以建立以H A 为 靶点的药理筛选模型对寻找抗H 5 N 1 高致病流感病毒药物具 有重要意义。 目的： 建立由流感病毒外壳蛋白( H A ) 与人类免疫缺陷病毒 H I V - 1 核心包装成的重组病毒药理筛选模型，寻找作用于H A 的抗H 5 N 1 高致病流感病毒的化合物并对其进行机制研究。 方法： ( 1 ) 应用W e s t e r nb l o t 和H A 抗体结合实验对H A 蛋白的表达 情况进行考查； ( 2 ) 应用流感病毒外壳蛋白质粒H A 与艾滋病毒核心基因组 质粒共转染，制备重组病毒H A ( V i e t ) H I V - I u c ， H A ( Q H ) H I V - l u c ，H A ( H 5 N 2 ) H I V - l u c ； ( 3 ) 应用重组病毒对不同细胞系感染实验对重组病毒的感染 能力进行考察； ( 4 ) 对不同病毒株进行稀释( 1 ：2 ，l ：4 ，1 ：8 ，1 ：1 6 ，1 ：3 2 ) ，绘 制滴度相关荧光素酶活性单位曲线，考察该模型进行定 量分析的可行性； ( 5 ) 应用H A ( V i e t ) H I V - l u c 模型对2 0 0 0 余种化合物进行初筛， 进一步地采用重组病毒H A ( V i e t ) M L V - G F P 、V S V G H I V - l u c 、V S V G M L V - G F P 和不同的细胞系对活性化合物 的作用靶点进行确定； ( 6 ) 应用M T T 法检测活性化合物对宿主细胞的毒性； ( 7 ) 将化合物与宿主细胞孵育不同时间，通过比较考察化合物 对宿主细胞表面受体表达的影响； 中文摘要 ( 8 ) 应用H A 介导的细胞细胞融合实验，进一步考察药物的作 用环节。 结果： ( 1 ) 对重组病毒模型H A ( V i e t ) 的表达采用了分子生物学的方 法进行考察：W e s t e r nb l o t 结果表明，转染4 8 小时后提取 宿主细胞蛋白，检测到H A 蛋白的表达，并且清楚看到 H A 0 和H A l 条带； ( 2 ) 通过磷酸钙转染法制备出外壳蛋白为血凝素H A ( 不同来 源) ，核心为H I V ( 报告基因为一l u c ) 的重组病毒，即 H A ( V i e t ) H I V - l u c 、H A ( Q H ) H I V - l u c 、H A ( H 5 N 2 ) H I V - l u c 。 病毒原液加入后感染2 9 3 E T 细胞，H A ( V i e t ) H I V - l u c 相关 荧光素酶活性单位( R L U s ) 达到2 x 1 0 7 ，接近F B l 5 荧光 检测器的最大检测值；H A ( Q H ) H I V - I u c 和 H A ( H 5 N 2 ) H I V - I u c 原液感染2 9 3 E T 细胞，其R L U s 分别 达到1 0 6 和1 0 5 ，比阴性对照组相的信号高3 5 个数量级， 表明模型已经初步建立； ( 3 ) 随后进行了重组病毒颗粒对人类不同组织来源的细胞系 进行感染性检测，结果表明重组病毒颗粒可以感染多种细 胞，尤其对2 9 3 E T 和A 5 4 9 细胞的感染性较强。抗体结合 实验结合结果显示抗H A 的多克隆抗体可以阻断病毒对 宿主细胞2 9 3 E T 和A 5 4 9 的感染。以上的实验证实重组病 毒H A ( V i e t ) H I V - l u c 具有高度感染能力。病毒滴度一相关 荧光素酶活性单位曲线可以清楚的反映出重组病毒核心 复制水平与荧光素酶报告基因表达水平间的剂量依赖效 应。因此，该模型可用于针对H A 侵入宿主细胞和H I V - 1 复制环节的双靶点药物筛选模型； 中文摘要 ( 4 ) 筛选2 0 0 0 余种样品得到3 个海洋来源的活性化合物 Y C U A 一6 ，Y C 一7 2 ，G C 一2 9 ，经过H A ( V i e t ) H I V 、H A ( V i e t ) M L V - G F P 、V S V G H I V - l u c 、V S V G M L V - G F P 四组模型 进行特异性比较，结果表明三个化合物在1 0 9 M 浓度下对 H A ( V i e t ) H I V - l u c 和H A ( V i e t ) M L V - G F P 的抑制率> 5 0 ， 而在相同浓度下对V S V G H I V - I u c 对照组模型的抑制率 6 0 ) T h es i t u a t i o n ，i n c l u d i n gm o r ea n dm o r e a f f e c t e da r e a s ，m o r ea n dm o r ed e a t hc a s e s ，i Sv e r yu r g e n t ；a sa r e s u l t ，t h eo u t b r e a ko fH 5 N 1i n f l u e n z av i r u sp a n d e m i ca l lo v e r t h ew o r l dw i l lh a p p e ni nf u t u r e T h e r ea r en oe f f e c t i v em e d i c i n ea n dw a y st oh i g h l y p a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a T h o u g hv a c c i n e sa r et h o u g h tt ob e a ne f f e c t i v ew a yt oa n t i i n f l u e n z av i r u s ，a n t i H 5 N1i n f l u e n z a v a c c i n e sf o rh u m a n sa r ei nr e s e a r c hb e c a u s eo fh y s t e r e s i sa n d v a r i a b i l i t y H i s t o r i c a l l y , M 2 i o nc h a n n e l p r o t e i ni n h i b i t o r s ， i n c l u d i n gr i m a n t i d i n ea n da m a n t a d i n e ，f i r s tw e r e f o rt r e a t i n g h i 曲l yp a t h o g e n i c a v i a n i n f l u e n z a ；b u t A m e r i c a nC D C s u g g e s t e dt os t o pu s i n gt h e mb e c a u s eo fC N C s id ee f f e c ta n dt h e 6 英文摘要 r a p i do c c u r r e n c eo fe m e r g e n c eo fd r u g - r e s i s t a n tv i r a l s t r a i n s N e u r a m i n i d a s e ( N A ) i n h i b i t o r sa r eo t h e ra n t i i n f l u e n z ad r u g s ， i n c l u d i n go s e l t a m i v i ra n dz a n a m i v i r I tw a sr e p o r t e dt h a tt h e r e w e r ea l s od r u g r e s i s t a n tv i r a ls t r a i n si nc l i n i c T h e r e f o r e ，i ti so f g r e a ti m p o r t a n c et of i n dan e wt a r g e tf o ra n t i i n f l u e n z av i r u so f H 5 N1 s u b t y p eb y an e wt e c h n i q u e H e m a g g l u t i n i n ( H A ) ，i s n e c e s s a r yi nt h ep r o c e s so fE n t r yw h i c hi sc r u c i a lf i r s ts t e pi n v i r u sl i f e c y c l e ，m a yb e au s e f u lt a r g e tf o rr e s e a r c hn e w a n t i i n f l u e n z ad r u g s H Ai sc o n s t i t u e n to ft w os u b u n i t sH A1a n d H A 2 ，w h i c ha r er e l e v a n tt or e c o g n i z i n ga n db i n d i n gt h er e c e p t o r i nt h es u r f a c eo fh o s tc e l l sa n dm e d i a t et h e p r o c e s s o f m e m b r a n e sf u s i o nr e s p e c t i v e l y O u re x p e r i m e n tw a n t st ob u i l da n e w p h a