同步荧光光谱法.

4-3 同步荧光光谱法 ( Synchronous Fluorescence) 一、同步荧光分析原理 同步荧光技术是同时扫描激发单色器和发 射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。由 测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图， 称为同步荧光光谱。 SYNCHR. EX. SCAN NOR. EM. SCAN NOR. EX. SAN NO FLUORE SCATTER LINE /nm nm 1、固定波长的同步荧光光谱 (Constant wavelength synchronous luminescence , CWSL) (1) 在同步扫描中，使激发波长与发射波长保持 固定的波长间距，即 常数。将 同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧光光谱图 ，则为固定波长的同步荧光光谱。 （2）定量依据 激发光谱强度分布 发射光谱强度分布 （2）同步扫描激发波长时的发射光谱 （3）同步扫描发射波长时的激发光谱 （2） （3） （1） （3）同步荧光光谱的特点 a. 同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。 它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性 ，因而使光谱分析的选择性得到改善。 b. 有利于多组分混合物的分析。同步荧光光谱 可以把强带增强而减小弱带的干扰。 c. 可消除 Raylei 干扰，使 Roman 强度降低 且拉宽。 （4） 的选择 只有当 恰好相当于某吸收带和其发射带之 间波长间距时，才能观察到同步信号。 = 斯托克斯位移 （发射波长与激发波长之差) 与狭缝宽度 d 的大致原则： 只受瑞利： 当同时受瑞利和拉曼散射干扰 测定波 拉曼散射光的波长 2、固定能量的同步荧光光谱 constant energy synchronous luminescence (CESL) 固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描 过程中，使激发波长与发射波长之间保持着 固定的能量差。 Ray Roman 常数 表示波数差 与 成正比 拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移 当或 时 固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射和拉 曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除瑞利 散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的复杂 性，提高选择性。 a b c F 二、同步扫描仪器设备 1、固定波长的荧光光谱的获得 对于以光栅为单色器的荧光分光光度计， 只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起 始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便 可进行固定波长同步扫描荧光测定。 2、固定能量同步扫描 是非线性的可变角同步扫描，需通过微处 理机控制而加以实现。 三、应用 1、在多环芳烃分析中的应用 减小光谱的重叠 （1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃 的测定 苊(Ace )，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)， 苯并芘(Bap)， 苝(Per) 用标准加入法计算2,3-苯并芴 （2）低温固定能量同步荧光法 煤液化样品中各种有机物 的同步荧光光谱 煤液化样品的固定波长同步 荧光光谱 2、同步荧光法在医药检验方面的应用 （1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸 二乙酰胺的测定 （2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽 （3）酪氨酸和色氨酸严重重叠 CWSL 的同步荧光 色氨酸的光谱特征 的同步荧光 酪氨酸的光谱特征 or 70nm 的二阶导数同步荧光可对 Trp 和 Tyr 分辨 同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨 （4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定 用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧 （5）尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定 总结： 荧光测量 稳态测量 时间依赖的测量 4-4 时间分辨荧光法 （Time Domain Fluorometry） (Time Resolved Fluorometry） 一、时间分辨法原理 用短脉冲光源激发的荧光体群体，随时间而 衰变，其衰变率为 受激分子的寿命 用 F(t) 或 N(t) 对 t 作图 1/e F(t) or N(t) t or t 荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的 1/e 所需要的时间。 特点： 采用适当的激发光源和检测体系，可以得 到在固定波长的荧光强度时间曲线和在固定 时间的荧光发射光谱。 （1）可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组 分进行分辨； （2）可消除杂质与背景荧光； （3）可测量溶剂松弛的时间。 二、时间分辨仪器设备 激发光源、时间延迟设备、激发单色器、 样品池、荧光单色器及设有门控的检测器 1、激发光源 短脉冲的激发光源 闪光灯 氮闪光灯 几条高强度射线 氢闪光灯 氘闪光灯 连续线 强度低 激光器 氮分子激光器 337.1 nm 氩离子激光器 351 nm 染料激光器 所需波长 光子通量大、峰值功率高、单色性好、发 生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有 较高的灵敏度和选择性。 2、检测器 如光电倍增管 带有门控的 三、时间分辨荧光的分析应用 荧光体的荧光寿命的测定 时间分辨荧光光谱 荧光发射的衰变曲线 1、荧光体混合物中两组分的同时测定 例 用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al 和Ga 15.20 ml 样品 + 1 ml 0.045% R + 2 ml 20% NH4Ac (or 20% NH4Cl ) 调 pH 至4.5，稀释至25 ml 氘灯激发 测定荧光强度时间曲线 （1）测定荧光衰变曲线 Al R Ga R 可利用上述两个荧光化合物的差异 对它们进行同时测定。 （2）计算含量 铝配合物和镓配合物的 衰变曲线 铝配合物和镓配合物的 对数衰变曲线 比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量 比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量 2、芳基的测定 例 用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解 作用所产生的芳基进行检测 （1）用25ps，266nm 激光脉冲使1-(氯甲基)萘， 1-(溴甲基)萘， 2-(氯甲基)萘， 2-(溴甲 基)萘等化合物离解产生芳基。 （2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激 发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm， 10ns，如图所示。 （a）和（c）一致，是1-萘甲基所致 （b）和（d）一致，是2-萘甲基所致 3、溶剂松弛时间的分辨测量 许多分子在基态时具有从中等到大的偶极 矩，在激发态时偶极矩发生变化，从而引起周围 溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶 质分子偶极的重新定向，这个过程称为溶剂松弛 ，这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。 在松弛过程中，能量有所降低，因而发射向 长波位移。 时间分辨荧光法可记录不同时间的发射光谱 ，因而可测量松弛时间。 例1 4-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶液 在不同的温度下的时间分辨的荧光光谱图 室温下， -132 荧光光谱与时间t无关 在-77K，荧光光谱与t 有关 在 4ns， 溶剂还未重新取向 在23ns， 溶剂取向已完成 例2 2-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料 溶剂 甘油 温度 A图 4 1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns B图 57 1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns 4-5 相分辨荧光法 （ Frequency-Domain Fluorometry /Phase-Modulation Fluorometry) The objective of both time-domain and frequency-domain fluorometry is to recover the parameter describing the time-resolved decay. 一、相分辨法原理 1、单指数衰变的荧光 当样品被激发光激发而发射荧光时，如激发 光的光强度被正弦调制，其角调制频率为，则 发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的时 间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟了 角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些， 也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光 要小些。 去调制因素 激发光和发射光的光强正弦调制 在测量相角（）或去调制因素（m）之 后，可以计算该荧光体的荧光寿命。相 分辨法是荧光寿命的测量方法之一。 m 10 MHz 30 MHz 10 MHz 30 MHz 、m与 的关系如下： m 随 的增大而下降 m=1 发射光与激发光的调制幅度相同 m 越小 发射光被调制的幅度越小 随 的增大而增大，寿命越长，延迟的 越大 。 当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟 的时间就越长。 2、多指数衰变的荧光 如果样品中含有两种荧光体，或者单一荧 光体而进行进一步激发态反应，则荧光是双指 数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指数 衰变。 由 和 m 所计算的 是表观荧光寿命。 如采用相灵敏检测器的相荧光计， 激发光的调制度（或振幅） 去调制因素 单一荧光体 对于相灵敏检测器 稳态荧光光谱 检测角度 在不同相角 测定荧光光谱，称为相 灵敏荧光光谱，即为在固定时间的荧 光光谱。 若样品溶液中含有 A、B 两种荧光体， 它们的荧光寿命分别为A和B。 如，则该组分的发射被抑制 要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把检测 器相角调节至和组分B正交。这是很费时的， 最好得到另外的信息: (1)先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调 节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光 光谱重叠，则可得到与另一组分正交的相角 。 (2)使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相 角。 当用相灵敏检测器在各种不同检 测器相角测绘样品的相灵敏荧光光谱 。对于单一化合物，其荧光峰波长基 本上保持不变而与检测器相角无关。 如果不是均匀的发射，则荧光峰随着 检测器相角而改变，在不同检测器相 角得到的相灵敏光谱是鉴别不均匀发 射的有力工具。 3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较 用于荧光参数测量的仪器可分为两大类 稳态测量 steady-state 时间依赖的测量 time dependent 相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上 都是时间依赖或时间分辨的测量。 （1）仪器 时间分辨荧光法的局限性 a. 仪器常常非常复杂，常局限于有关专家使用； b. 灵敏度常低于稳态测量。 相分辨法的优点 a. 仪器类似于稳态测量的仪器，使用简单； b. 灵敏度高； c. 数据处理快。 （2）测量参数 a. F(t)-t 曲线 时间分辨 b. m. . 相分辨 （3）从实验的观点，相分辨有下列优点： 在时间分辨的方法中，测量的延迟信号的去卷 积对于计算测量系统的限定时间的响应是必要的 ，而相分辨法不受此限制； 相分辨法允许不同方向的直接测量。如在各向 异性的延迟测量中，平行和垂直偏振成份的 和 m 的测定； 相分辨法为基于荧光寿命差异的光谱成份之直 接分辨提供了一种简单、有效的方法。 二、相分辨仪器设备 与一般荧光分光光度计大致相似 ，但增加了光调制器及测量相角和去 调制因素的设备。 1、光调制器 （1）Kerr 调制器 不能透射UV （2）Pockels调制器 需要较低电压，能透过紫外光，可在连续 可 变的频率下操作，但要求高