园艺植物组织培养-第2章.

第二章 实验设备及培养条件 *Huo XW, IMAU 实验室 培养条件 OUTLINE DateHuo XW, IMAU 一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配 置室、无菌室、培养室、观察室等。在实际中可结合可 行条件，合并一部分。 一、洗涤室(clean-up room) 二、准备室(media preparation room) 三、接种室(transfer room, sterilized room or a chamber for transferring cultures) 四、培养室(culture growing room) 第一节 实验室 DateHuo XW, IMAU 光照培养室 DateHuo XW, IMAU 接种室 DateHuo XW, IMAU 一、洗涤室(clean-up room) 二、准备室(media preparation room) 准备室还应配备以下仪器设备： (1)工作台 (2)药品柜 (3)普通冰箱 (4)电子分析天平和托盘天平 电子分析天平 (5)电蒸馏水器 (6)磁力搅拌器 (7)恒温水浴锅 (8)电炉或电饭锅 (9)酸度计 (10)培养基分装设备 (11)高压灭菌锅 (12)恒温培养箱 (13)烘箱 DateHuo XW, IMAU 三、接种室(transfer room，sterilized room ) 接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天 花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒 。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 接种室要求干爽安静，清洁明亮。 在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射 灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这 样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。 接种室应设有缓冲间，面积2平方米为宜。 DateHuo XW, IMAU 接种室的主要设备及用具有： (1)接种箱 (2)超净台Sterilized facility (3)解剖镜 (4)无菌操作用的器具 按单人超净台上用量有：酒精灯1个；20- 25cm长的医用镊子1把；解剖刀；医用剪；广口 瓶，内放酒精，用于浸泡镊子、刀、剪等；用 于架放灼烧过的刀、镊子的小架。 DateHuo XW, IMAU 四、培养室(culture growing room) 培养架:培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离 地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m 左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用 40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm 。 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右. 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70-80为好 。 控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10 -16h也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件， 长日照 植物需要长日照条件。 DateHuo XW, IMAU 第二节 培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件，培养基组成、pH值、 渗透压等各种化学环境条件都会影响组织 培养育苗的生长和发育。 DateHuo XW, IMAU 一、温度(temperature) 不同植物繁殖的最适温度不同，大多数在20-30，通常 控制在（25+2）恒温条件下培养。 温度过低（15）或过高（>35）都会抑制细胞、组 织的增殖和分化，不利于培养物生长。 一些例外情况。利用细胞培养、低温保存植物资源时，可 在-196条件下限制其生长，延长存储时间。 不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20、月 季是25-27，番茄是28。 温度影响植物组织培养育苗的生长速度，分化增殖、器官 建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在 12以下，33以上形成率皆最低。 DateHuo XW, IMAU 不同培养目标采用的培养温度也不同。 百合鳞片在30-C以下再生的小鳞茎的发叶速度和百 分率都比在25 以下的高。桃胚在2-5条件进行一定 时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35处 理草莓的茎尖分生组织3-5d，可得到无病毒苗。 低温预处理利于培养。 在烟草花药培养中，在5下预处理48h后进行培养 ，能促进体细胞的形成。 在确定某种培养物的适宜温度时，要考虑原植物的生态 环境才能获得最佳效应。例如，生长在高海拔和较低温 度环境下的松树，若在较高温度下培养，试管苗生长十 分缓慢。 DateHuo XW, IMAU 二、光照(1ight) 1光照强度(1ight intensity) 光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容 易徒长。 一般培养室要求光照1216h/d，光照度1000-5000lx。 不同的培养物对光照有不同的要求。一些植物（如荷兰芹 ）的组织培养中，其器官形成不需要光；而另一些植物， 如黑穗醋栗，光条件下可显著提高其幼苗的增殖。 同一种植物对光照的要求也不同。 百合原球茎在暗培养下长出小球茎，在光照条件下长 出叶片。对短日照敏感的葡萄品种，其茎段的组织培养只 有在短日照条件下才能形成根；对日照强度不敏感的品种 则在任何光周期下都能生根。 DateHuo XW, IMAU 2. 光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化 都有明显的影响。 不同的光波对器官分化关系密切。例如，在杨树愈伤组 织的生长中，红光有促进作用，蓝光则有抑制作用。而 蓝光明显促进绿豆下胚轴愈伤组织的形成。 在烟草愈伤组织的分化培养中，起作用的光谱主要是蓝 光区，红光和远红光有促进芽苗分化的作用。 在试管苗生长的后期，加强光照强度，可使小苗生长健 壮，提高移苗成活率。 DateHuo XW, IMAU 3光周期(1igh period) 最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 一般来说，黑暗条件下有利于细胞、愈伤组织的增殖， 但器官的分化往往需要一定的光照。 研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照 下易分化，而在长日照下产生愈伤组织。 有的植物需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在黑 暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 DateHuo XW, IMAU 三、湿度(humidity) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件。 培养容器湿度常可保证100% 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，组织培养 室内一般要求保持70%80%的相对湿度 环境湿度过高、过低都不利于培养物生长：过低会造成 培养基失水干枯而影响培养物的生长分化；过高会造成 杂菌滋长导致大量污染。 湿度不够可经常拖地或利用保湿机，湿度过高可利用去 湿机或通风除湿。 DateHuo XW, IMAU 四、渗透压(penetrating pressure) 渗透压影响植物细胞的脱分化和再分化及器官的形成。 植物细胞和培养基之间处于等渗或略低于培养及的渗透 压时，才利于汲取养分和水分。 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物影响到渗透 压的变化。 多数植物适宜的糖浓度为2-6%。 通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以 上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长 就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。 DateHuo XW, IMAU 五、pH值 外植体的培养增殖都要求一定的pH值。 通常培养基的pH值以在5.46.0之间较好。 如果pH值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进 而影响外植体的脱分化、增殖和器官形成。 不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的大多在 5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8. 不同植物的最适PH值 种 类 最适PH值 种 类 最适PH值 杜 鹃 40 月 季 58 越 桔 45 胡萝 、石刁柏 60 蚕 豆 55 桃 70 番茄、葡萄 57 DateHuo XW, IMAU pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不 同。 以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样， 后者较高一些。 当pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时， 琼脂不能很好地凝固。 高温灭菌会降低pH值(约0.2-0.3个pH值)因此在 配制时常提高pH值0.2-0.3单位。 pH值大小调整可用0.1M的NaOH和0.1M的HCI 来调整。lml的NaOH可使pH值升高0.2单位， lml的HCI可使pH值降低0.2单位。 DateHuo XW, IMAU 六、气体(Oxygen) 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考 虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。 固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于 发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等， 同时要考虑容器的类型、培养基等。 在接种时应避免把整个外植体全部埋人琼脂中， 否则造成缺氧窒息。 DateHuo XW, IMAU 胡萝卜细胞悬浮培养有两种再生植株的途径： 先形成根再长成小植株， 形成胚状体后再成苗。 与液体培养基中存在的氧浓度有关，当培养基中氧 浓度低于临界水平时，促进形成胚状体，当氧浓度 高于临界水平，则有利于形成根。 氧对器官的发生可能有重要的调节作用。 DateHuo XW, IMAU 在番茄幼胚培养中，发现幼胚在氮气和大气中 的生长完全相同。但也有报告认为，在周围大 气环境中，氮气或者低浓度的氧，似乎阻碍胚 的正常培养，出现“早熟萌发”。 培养物释放的微量乙烯和高浓度二氧化碳，有 时会有利于培养物的生长，有时则会阻碍培养 物的生长，甚至会对培养物产生毒害 定期打开培养瓶盖进行调节，或使用透气性较 好的封口材料以利气体交换。 DateHuo XW, IMAU 下一章 DateHuo XW, IMAU